[发明专利]一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定殖数量检测的方法。

背景技术

产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)是一种以草酸作为唯一的碳源和能源的专性厌氧的革兰氏阴性菌。它是Milton J.Alison于1985年在绵羊的瘤胃中首先发现的(Allison MJ，Cook HM，Miline DB，Gallagher S，Clayman RV.Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans.J.Nutr.(1986)116：455-460.Allison MJ，Dawson KA，Mayberry WR，Foss JG.Oxalobacterformigenes gen.nov.，sp.nov.：oxalate-degrading anaerobes that inhabit thegastrointestinal tract.Arch Microbiol 1985；141：1-7.)，并进一步又在猪、大鼠和人等肠道或粪便内被分离到。草酸是一种人体内主要由肝脏行成的代谢终产物，也广泛存在于包括菠菜、巧克力、茶等食物和饮料中。这一物质是人的草酸钙肾结石中的主要成分。草酸在人的尿中的浓度高低对肾结石形成与否起着重要作用。现有研究表明产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)不仅能够通过降解食物中的草酸以减少肠道对食物中草酸向血液中的吸收，并且能够与肠道黏膜相互作用导致血液中过高的草酸向肠道反向转运，达到降低血液中的草酸的浓度，进而降低尿中草酸的浓度。然而，很多研究显示产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)在肾结石病患者的肠道内的定殖率明显低于在健康人的肠道内的定值率，这说明该菌株的定殖与否是肾结石形成的主要因素之一。更重要的是，现已发现肾结石疾病的再发率同样与产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)的定殖有重要的关系，研究表明二者成显著的负相关性。产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)已经被用于治疗高草酸症疾病的研究中。研究显示该菌株作为益生菌剂口服进入该病患者体内，能够显著改善患者尿中草酸的含量。因此，产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)在肠道内定殖数量对于肠道内草酸含量以及血液中草酸含量降低至关重要，对于该菌株数量的检测在产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)在预防和治疗肾结石疾病以及与草酸有关的疾病如高草酸症的治疗中的应用必将具有深远的重要意义。

现有检测粪便中产甲酸草酸杆菌数量的方法有Roll-Tube法、QT-PCR法、实时PCR法。现有的这些产甲酸草酸杆菌检测方法还存在以下的缺点和不足：

1、Roll-Tube法：Roll-Tube法主要是利用稀释培养法，在一种叫Roll-Tube的管中，将含产甲酸草酸杆菌的粪便样品与培养基先稀释再混合培养一定时间(一般为4-5天)，计算管壁上透明圆圈的数量即为所检测的菌数。该方法的缺点是不得不使用大量的厌氧设备，而且不得不大量配制培养基。在菌落计数过程中，是以计算在Roll-Tube管壁上透明圆圈，而制备培养基时极容易产生气泡，这就导致了很大程度的误差。概括起来，该方法最大的缺点是费时费力，获得结果周期长。

2、QT-PCR法：Sidhu等(1999)为了解决Roll-Tube法费时费力的缺点，发明了QT-PCR法。QT-PCR法是将所有粪便样品提取DNA，然后设计引物做常规PCR，在琼脂糖凝胶电泳上检测PCR产物的亮度，与事先测得的产甲酸草酸杆菌的PCR产物的标准曲线比较，计算后获得菌数。该方法快速、但它存在致命的缺陷是PCR产物的浓度不能完全代表原始PCR模板的浓度(即所要测试的产甲酸草酸杆菌的DNA浓度)，当模板浓度过大或过小，该方法不能真实反映实际所要测试的产甲酸草酸杆菌的定殖数量，最终导致检测结果误差较大。