[发明专利]利用酯酶同工酶电泳法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法

说明书

技术领域

本方法属于种子质量检验领域，涉及杂交水稻种子纯度的检验方法，特别是一种利用酯酶同工酶电泳法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法。

背景技术

我国首创的两系杂交水稻技术经过多年的研究，目前已大面积推广应用。但由于两系杂交水稻的母本为一种光、温敏核不育系，易受外界环境影响，经研究，当环境温度低于23.5℃时，不育系的育性开始转化，能够自交结实，影响杂交种子纯度。为保证两系杂交水稻种子用种安全，必须强化对杂交种子的纯度检测。

种子纯度鉴定通常采用田间小区种植鉴定和室内纯度检验，田间小区种植鉴定是一种后控检验法，杂交水稻通常在海南进行越冬种植鉴定，一般在次年3月下旬才获得鉴定结果，这往往滞后于种子的销售行为。因此，此法不能很好地满足种子生产经营的需要。室内纯度检验通常采用DNA指纹鉴定技术和蛋白质指纹鉴定。DNA指纹鉴定技术，直接检测品种DNA序列间的差异，不受环境和人为因素影响，是纯度分析的理想技术，但其技术较为复杂、操作不易掌握、费用较高、耗时相对较长，一般种子企业很难大规模使用。蛋白质指纹鉴定是利用品种间的遗传差异形成蛋白质的多态性，通过电泳技术得到多态性的蛋白质指纹图谱，从而用于鉴别不同品种的真实性和纯度，即蛋白质指纹鉴定技术。该方法虽然具有相对较为简单，便于操作、省时快速，成本低廉等优点，但尚有许多不足之处，尤其是准确性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用酯酶同工酶电泳法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法，以提高种子纯度快速检验的准确性。

其技术方案是：一种利用酯酶同工酶电泳法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法，其特征在于：对以广占63S为母本的两系杂交水稻品种丰两优一号、丰两优三号、丰两优香一号的父母本和杂交一代的酯酶同工酶进行电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，用于对杂交一代种子受检样品的纯度检验；其具体步骤是：

1)样品酯酶同工酶的提取：将种子浸泡24小时置床做发芽，取发芽3-4天的幼芽放入1.5ml离心管中，加入100μl含40％蔗糖和pH8.0的0.4mol/L三羟基氨基甲烷一盐酸的提取液，冰浴磨碎后，用冷冻离心机分离，提取酯酶同工酶制备液；

2)置板、灌胶：将垂直板电泳槽玻璃板两侧用凡士林封住后，用琼脂糖封住底部；玻璃板之间按20ml量倒入分离胶；待分离胶凝固后，再按8ml量倒入浓缩胶，插入样品梳；

3)点样：浓缩胶凝固后，拔去样品梳，每孔点入20μl酯酶同工酶制备液；

4)电泳：点样结束后，电泳仪在稳压300v的条件下，以20mA电流电泳，待指示剂线过浓缩胶后，调至30mA，电泳时间为2.5小时；

5)染色：指示剂线离胶板底部约1cm时结束电泳，取下胶片，先在由A预处理液和B预处理液组成的混合液中预处理20分钟，再置于由A预处理液、B预处理液、固蓝B盐和丙酮组成的混合液中进行染色20分钟，水洗后，即获样品电泳谱带。

6)受检种子纯度检验：用上述方法分别获取标准电泳谱带和受检样品电泳谱带，将受检样品的电泳谱带与标准电泳谱带进行对照比较，获得受检样品的种子纯度。

其技术效果是：通过本发明的方法，对丰两优一号、丰两优三号、丰两优香一号样进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致(详见附表1)。

附表1：应用酯酶同工酶室内检测纯度与田间种植鉴定纯度对照表

同时，通过该方法对广占63S的衍生系为母本的两系杂交水稻品种丰两优四号、新两优六号、两优6326的杂交一代种子纯度进行检验，其准确度也很高。适用于以广占63S及衍生系为母本的两系杂交水稻品种及其亲本真实性和种子纯度的检验。

附图说明

图1是以广占63S为母本的两系杂交水稻亲本及其F₁的特性谱带。图中♂表示缺第4条带，♀表示缺第3条带。F16条带全，其中第3、4条带色淡。

具体实施方式

一种利用酯酶同工酶电泳法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法，其具体步骤是：

1)样品酯酶同工酶的提取：将种子浸种24小时后，按GB/T3543.4中的规定置床发芽，取发芽3-4天后的幼芽放入1.5ml离心管中，加入100μl含40％蔗糖和pH8.0的0.4mol/L三羟基氨基甲烷(Tris)-盐酸(Hcl)的提取液，冰浴磨碎后放入冷冻离心机分离，提取上清液，上清液即为酯酶同工酶制备液。