[发明专利]缺失型人β干扰素及其重组制备

说明书

技术领域  本发明涉及DNA重组技术和药物领域，涉及重组缺失型人β干扰素，含编码该缺失蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。 

背景技术  人β干扰素是成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广泛生物学活性，包括抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用的重要细胞因子(KozovsKa ME，et al.Neurology〔J〕，1999，53：1692-1697)，具有5个α螺旋和22KDa的分子量，其中β干扰素-1b无糖基化，其分子量为18KDa(Arduini，et al.Protein Science〔J〕，1999，8：1867-1877)。目前人β干扰素分为β干扰素-1a和β干扰素-1b，其中β干扰素-1a是天然结构，包含有糖基化结构，而β干扰素-1b是将17位的Cys突变成Ser而成，且N端不含甲硫氨酸，由165个氨基酸组成(Goodkin DE，et al.Lancet〔J〕，1994，344：1057-1060)。大量研究表明，人β干扰素可在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中实现稳定高效的表达(Jacobs L，et al.Curr Opin Neuro〔J〕，1994，7：250-254)。1993年以来国外已批准多种重组β干扰素上市用于治疗多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)。 

国外用于临床的IFN-β有IFN-β-1a和IFN-β-1b两种类型，均系基因重组产品。β干扰素作为治疗多发性硬化症的药物已经在国外上市的有先灵公司的Betaferon、诺华欧化公司的Extavia以及雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex。其中先灵公司的Betaferon和诺华欧化公司的Extavia属于IFN-β-1b，通过在E.coli中以包涵体形式表达的重组人β干扰素-1b，工艺中需经SDS变性后再复性。而雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex是通过CHO(Chinese hamster ovary)表达的重组人IFN-β-1a。重组IFN-β-1b和IFN-β-1a在结构与生物活性方面存在明显的差异，主要表现为CHO表达的IFN-β-1a的体外抗病毒比活性高于大肠杆菌包涵体表达制备的IFN-β-1b。 

本发明提供了一种缺失型人β干扰素突变体Δ11-IFN-β及其表达制备的方法，制备的蛋白不仅溶解性更好、稳定性更高，同时具有更高的抗病毒活性。 

发明目的  目前人β干扰素-1b(IFN-β-1b)在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，工艺中需用SDS先变性后再复性，制备工艺相对复杂，且含有SDS的残留，其抗病毒比活性仅为2×10⁷IU/mg；人β干扰素-1a(IFN-β-1a)是以CHO细胞为宿主细胞表达的有糖基化的糖蛋白， 抗病毒比活性为2×10⁸IU/mg(Laura Runkel，et al.Pharmaceutical Research〔J〕，1998，15：641-649)。 

本发明重组制备的缺失型人β干扰素突变体与天然结构比具有溶解性更高、稳定性更好的优势。制备的重组缺失型人β干扰素突变体包括：Δ11-IFN-β-1a和Δ11-IFN-β-1b。其中，Δ11-IFN-β-1b采用大肠杆菌以融合表达的方式表达制备，其N端第1位氨基酸可替换为甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)，第6位氨基酸为丝氨酸(Ser)；而Δ11-FN-β-1a可采用酵母细胞或CHO细胞表达制备，其N端第1位氨基酸可替换为甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)，第6位氨基酸为半胱氨酸(Cys)。其次，该重组缺失型人β干扰素突变体蛋白的第1位氨基酸前可带有甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)。 

构建的表达Δ11-IFN-β-1b的工程菌经发酵罐扩大培养后，加入IPTG诱导后收集菌体。在特定的破菌缓冲液中破菌后离心收集上清，通过Ni柱纯化回收融合蛋白，经特定的蛋白酶酶切后通过离子交换和反相C₁₈柱精纯化，制备的重组Δ11-IFN-β-1b抗病毒生物学比活性达到7.3×10⁷IU/mg以上。构建的表达Δ11-IFN-β-1a酵母细胞或CHO细胞株经扩大培养后分泌表达的Δ11-IFN-β-1a，经进一步的分离纯化制备的Δ11-IFN-β-1a抗病毒生物学比活性分别达到3.1×10⁸IU/mg和4.3×10⁸IU/mg以上。