[发明专利]乳腺癌干细胞分离纯化方法

权利要求书

1.一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：所述分离纯化方法用免疫磁珠分选系统分离乳腺肿瘤中的癌症干细胞，包括以下三个步骤：

a.制备单细胞悬液；

b.免疫磁珠阴性分选，分离去除乳腺癌细胞中的正常细胞；

c.免疫磁珠阳性分选，纯化乳腺癌干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：a步骤为：将肿瘤样品切成小块，移送到酶溶液中，37℃水浴培养30～40分钟，显微镜下检测，若成细胞团或单个细胞，即加血清终止消化，无血清培养液清洗，离心除去上清，用MACS缓冲液重悬细胞，过45μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至10⁷/ml。

3.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：b步骤为：将LINEAGE阳性抗体加入步骤a得到的细胞悬液，3～5℃孵育20～30分钟后，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，混匀，放置20分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗LD磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，收集到的洗液为去除癌症组织中正常细胞的肿瘤细胞。

4.根据权利要求3所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：所述LINEAGE阳性抗体包括CD2，CD3，CD10，CD16，CD18，CD24，CD31中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：加入LINEAGE阳性抗体的比例按每5μl抗体相对于2×10⁷个细胞/200μl细胞悬液。

6.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：c步骤为：将步骤b得到的细胞悬液离心，洗涤后重悬在MACS缓冲液中，将抗CD44抗体加入细胞悬液中，3～5℃孵育20～30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞，离心去除多余的抗体，用MACS缓冲液重悬细胞，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，4℃放置20分钟，加MACS缓冲液冲洗，离心去除游离的兔抗鼠免疫磁珠，弃除上清，再以MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗LD磁性分选柱，将细胞悬液过柱，用MACS缓冲液洗柱两次，去除非标记细胞，移柱出磁场，用MACS缓冲液洗柱，收集洗液，此为CD44阳性CD24阴性或弱阳性的乳腺癌肿瘤干细胞。

7.根据权利要求6所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：加入抗CD44抗体的比例按1.5μl抗体相对于2×10⁶/100μl细胞悬液。