[发明专利]利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法

权利要求书

1.一种利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法，其特征在于工艺步骤如下：

A、工程菌株BL21-DE3的增菌发酵

按大肠杆菌的常规发酵条件及方法，将初始菌种接种入种子罐，TSB为基础培养液，30℃下通气培养5小时后转入生产罐仍以TSB为基础培养液，调节PH值至7.0，30℃下通气培养12小时；

B、发酵液中添加色氨酸底物后进行的次生代谢发酵

在步骤A增菌发酵12小时之后，于发酵液中加入溶解在pH7.8磷酸缓冲液中的色氨酸溶液，使色氨酸最终浓度达到50％；，同时加入3～5g/L的吐温60阻滞菌体增殖，在发酵罐中通气1-2小时后停止转化，通气量1L/min，温度为35℃，并用HPLC检测反应进程；

C、发酵液中色氨酸/5-羟基色氨酸含量的监控

用反相色谱柱DIMONDC18(5μm，4.6X 250ram)，检测波长为280nm，流动相为甲醇∶水＝15∶85(v/v)，流速为1.0mL/分钟，进样量为20μl，灵敏度0.01AUFS，柱温为室温；以色谱峰面积积分值对浓度进行回归，得线性方程Y＝-258332+1.308413×106X(r＝0.9991)，RSD＝0.68％，5-羟基色氨酸含量在0.8-4g/ml范围内，含量与峰面积积分值呈良好的线性关系；

D、发酵液5-羟基色氨酸的分离纯化

发酵液停止转化后，离心收集上清液，调节pH值至5.9，收集沉淀，以30％碳酸钠溶液溶解，溶液以HPD-400大孔吸附树脂对5-羟基色氨酸富集，上柱条件：浓度为1.5mg/ml的5-羟基色氨酸，以500ml/分钟的速度通过HPD-400大孔吸附树脂柱，上样体积与湿树脂的质量之比为2∶1，40％乙醇以500mL/min的流速洗脱，洗脱液体积与湿树脂的质量之比为20∶1；洗脱液再经直接过聚酰胺树脂分离除去底物L-色氨酸，上柱条件：浓度为1.0mg/ml的5-羟基色氨酸，以200ml/分钟的速度通过聚酰胺柱，5-羟基色氨酸与聚酰胺树脂的重量比为0.25∶1，上样体积与湿树脂的质量之比为2∶1，20％乙醇以200mL/min的流速洗脱；洗脱液真空浓缩后，再将浓缩液的醇浓度调整到35％，在5～15℃的温度下1～3天结晶完全得5-羟基色氨酸产物。

2.如权利要求1所述利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法，其特征在于：步骤D所述5-羟基色氨酸第一次结晶物的纯度＞90％，重结晶后的纯度＞95％。

3.如权利要求1所述利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法，其特征在于：所述工程菌株BL21-DE3由家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸羟化酶基因构建重组表达载体，通过质粒转化得到。

4.如权利要求1或3所述利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法，其特征在于：所述工程菌株BL21-DE3的具体制备方法如下：

纯化提取来自兔脑组织匀浆基因组DNA，利用文献“Proc NatlAcad Sci USA.1987 Aug；84(16)：5530-4”报道的家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸羟化酶基因序列设计引物进行克隆，克隆片段用BamHI内切酶酶切，优化酶切条件，使酶切获得的片段在1kb-6kb之间；回收这些片段，连入到通过同样处理的pUC18质粒上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5a，转化后涂色氨酸显色平板，筛选获得一株具有明显水解活力的克隆，提取质粒，BamHI酶切表明插入重组质粒上来自基因组的片段为3kb，测序表明在该片段上有一个完整的ORF阅读框架，测序表明该基因与文献报道的兔色氨酸羟化酶基因具有同源性。利用上述基因序列设计PCR模板，构建PET30质粒，将构建好的质粒通过电转化法导入大肠杆菌E.coilBL21-DE3，获得转基因菌株。