[发明专利]同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及4-羟基脯氨酸的合成方法。

背景技术

肾结石最普遍的形式是草酸钙结石，占所有病例的80％。草酸的前体是乙醛酸。乙醛酸的水平正常情况下保持在一个平衡水平。它这种平衡水平是通过两种重要的(酶丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶和乙醛酸脱氢酶)将乙醛酸转变为乙醇酸。这样，乙醛酸不能在体内大量积累。而当乙醛酸大量积累，就会增加形成草酸机会。研究表明4-羟基脯氨酸是在体内能够被降解成乙醛酸。有报道显示，随着人体摄入4-羟基脯氨酸的提高，尿中的草酸含量也随之大量能够增加，形成结石的几率相应增加。因此，研究4-羟基脯氨酸在体内的代谢以及4-羟基脯氨酸对产生乙醛酸的影响程度对于了解肾结石的成因具有重要意义。通过对4-羟基脯氨酸代谢的研究还可以通过控制4-羟基脯氨酸的摄入量、以及研究有关药物抑制4-羟基脯氨酸氧化酶，以达到降低从4-羟基脯氨酸生成乙醛酸的几率，从而降低草酸形成的几率达到预防和控制肾结石的目的。然而，在使用¹²C组成的4-羟基脯氨酸研究4-羟基脯氨酸的代谢过程中发现，细胞或人体本身能够大量合成该物质，而且¹²C组成的乙醛酸来自很多途径，这就使我们不能准确地计算4-羟基脯氨酸的代谢对乙醛酸生成的贡献率。如果我们不能确定4-羟基脯氨酸到底能够对产生乙醛酸，继而产生草酸有多大程度影响，对于从控制4-羟基脯氨酸的代谢的角度控制肾结石就没有任何意义。这是¹²C的4-羟基脯氨酸在实际应用中的弊端。¹³C标记的4-羟基脯氨酸则很好的克服了这一难题，正常情况下细胞乃至人体只能合成¹²C组成的4-羟基脯氨酸，在代谢过程中，无论来自何种途径，只能产生¹²C组成的乙醛酸；因此，如果在培养细胞或让人体摄入¹³C标记的4-羟基脯氨酸，检测¹³C标记的乙醛酸，以及¹³C标记的乙醇酸、草酸，然后计算比率，我们就能准确地分析4-羟基脯氨酸对乙醛酸乃至草酸生成的贡献率。但是目前为止，没有任何可供研究使用的商业化的¹³C标记的羟基脯氨酸。

目前4-羟基脯氨酸的制备方法，采用传统的胶原蛋白工业化酸水解、纯化法：哺乳动物的胶原蛋白富含化合态4-羟基脯氨酸，在体内它是通过脯氨酰-4-羟基化酶以脯氨酰-L-脯氨酸为底物合成的，因此商业化的该产品多通过酸水解胶原蛋白，然后纯化获得的；但是该方法不足之处是获得的4-羟基脯氨酸全部是¹²C组成的4-羟基脯氨酸，而且纯化工艺复杂、时间长。

采用微生物合成方法：Shiasaki等从指孢囊菌(Dactylosporangium sp.strainRH1)大量筛选分离到能够将游离L-脯氨酸合成4-羟基脯氨酸；他们将其在大肠杆菌中表达，并且对大肠杆菌的ProB变成ProB⁷⁴，最终获得能够用于以葡萄糖或L-脯氨酸为底物发酵生产4-羟基脯氨酸的大肠杆菌工程菌株；该方法已被用于合成4-羟基脯氨酸；然而，该方法与上一方法相比，虽然在后期纯化更加方便了，但是仍然只能主要用于生产¹²C组成的4-羟基脯氨酸。这是因为即使将底物变成¹³C标记的葡萄糖或L-脯氨酸，能够合成¹³C标记的4-羟基脯氨酸，但缺点是如以¹³C标记的葡萄糖为底物后期纯化太复杂，产生的¹³C标记的物质太多，而如以¹³C标记的L-脯氨酸为底物，在大肠杆菌内合成¹³C标记的4-羟基脯氨酸的同时，¹³C标记的L-脯氨酸会被大肠杆菌内具他酶降解，造成不必要的浪费，¹³C标记的L-脯氨酸本身价格昂贵，约合1500美元/克，因此该方法不适用于合成¹³C标记的4-羟基脯氨酸。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有制备4-羟基脯氨酸的方法不适用于合成¹³C标记的4-羟基脯氨酸的问题，而提供同位素¹³C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法。