[发明专利]启动子miR172c及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种启动子miR172c及其应用。

背景技术

启动子按其作用方式和功能可以分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在所有组织中都能启动表达，有表达的持续性，没有时空特异性，如CaMV35S启动子等。该类启动子得到了大量研究和应用，在基因工程中发挥重要作用。但由于其表达不分时空，会导致外缘基因表达的过量积累，会影响植物正常的生长发育。因此，寻找诱导型或组织特异性的启动子，对于基因功能研究和转基因育种都具有重要作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有组织特异启动子功能的DNA片段。

本发明所提供的DNA片段，为如下1)、2)、3)或4)所示：

1)序列表中序列1所示的DNA片段；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA片段；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。

扩增上述任一所述DNA片段全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列2所示，另一条引物序列如序列表中序列3所示。

含有上述任一所述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

上述任一所述DNA片段在使目的基因在植物根中表达中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述根中具体为根的中柱中。

上述应用中，所述植物为单子叶植物。

上述应用中，所述单子叶植物为水稻。

上述任一所述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述植物为水稻。

实验证明，本发明的miR172c DNA片段是一启动子，且该启动子有很强的特异表达活性，特异的在植物的根的中柱中表达。本发明启动子为特异表达的基因功能研究和植物的转基因育种提供了有利工具，具有重要意义。

附图说明

图1为PCR扩增得到miR172c的启动子。

图2为表达载体的酶切鉴定。

图3为PmiR172c-1391-GUS载体示意图。

图4为转基因水稻的PCR鉴定。

图5为miRNA172c启动子在根中的GUS活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、启动子的制备及特异表达验证

一、启动子的制备及确认

1、水稻基因组DNA的提取

(1)取日本晴水稻叶片，加入液氮，充分研磨后，将粉末倒入1.5ml离心管中；

(2)待离心管中液氮挥发完全后，立即加入500ul DNA提取缓冲液(0.1mol/LTris·HCl(pH 8.0)，0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，0.5％SDS)，充分混匀后，65℃保温30分钟，期间不断温和上下颠倒离心管，使样品与缓冲液充分混合；

(3)以12,000rpm室温离心15分钟；

(4)将上清液转移至另一离心管；

(5)加入等体积tris-酚，抽提一遍；

(6)再用等体积的氯仿抽提一遍；

(7)取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，-20静置10分钟，以12,000rpm离心10分钟；

(8)用70％的乙醇洗剂，DNA沉淀在超净工作台吹干后，用灭菌双蒸水溶解备用。

2、PCR扩增

以水稻基因组DNA为模板，用引物对P1和P2进行PCR扩增。

引物序列如下：

P1：GTCGATCGGTCAGTTCGTCCA(序列2)

P2：CGACCCTACAACGAACGGGCTGT(序列3)

反应体系如下：

PCR程序：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图1所示(M：Marker；P：PCR扩增产物)。回收目的条带。

将目的产物与载体EZ-T连接，连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取单克隆；将单克隆接种于液体培养基培养，提取质粒，将质粒进行测序。测得的序列如SEQUENCE ID：1所示，将得到的阳性重组质粒记作PmiR172c-EZ-T，将SEQUENCE ID：1所示的DNA片段记作miR172c。