[发明专利]一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是池塘底泥样品总DNA的提取方法。

背景技术

池塘底泥中富含细菌、病毒、原生动物、寄生虫卵和其它微生物，其微生物多样性丰富、群落结构复杂。研究底泥微生物种群结构的时空动态变化，分析养殖池塘底泥微生态的功能变化趋势，一直具有十分重要的学术意义和应用价值。早期的微生物研究多采用传统的培养方法，主要是根据微生物的个体形态、培养特性和生理生化等特征，运用平板计数、镜检等方法进行环境微生物学研究。然而环境中能被分离培养的微生物种类只占自然界微生物总量的1％左右，通过传统方法得到的研究结果并不能真实、全面反映出养殖池塘底泥微生物的真实情况，难以获得微生物群落结构和空间分布的有关信息。

随着近十余年来分子生物学技术的日益成熟，池塘底泥的研究也得到了进一步的发展。借助分子生物学手段可以进行微生物的特异性检测，分析微生物群落的组成、结构和种群演替状况，不过开展这些研究的前提是建立高效、可靠的微生物总DNA提取方法。目前关于从土壤、水体、海洋沉积物取DNA的方法已得到较好发展，如专利CN101372689A、CN101230342A中分别介绍了土壤基因组DNA的两种提取方法，CN1824809A介绍了一种水生动物粪样细菌DNA提取试剂盒及其使用方法，和CN1584051A提出了一种分析城市污水污泥微生物群落构成的方法等。不过由于土壤、污泥等环境样品成分复杂，所含腐殖质和微生物类群存在较大的差异(如菌种的多样性、大小和丰度)，从而导致不同提取方法获得的DNA质量差异较大。对于有机质含量丰富的土壤或活性污泥样品来说，“机械破壁+酶作用”的提取方法对样品中腐植酸等杂质的去除能力有限，所得总DNA中残余的腐植酸或其它一些杂质会对后续的PCR扩增、酶切和克隆等操作造成非常大的影响。

池塘底泥样品在物理、化学性质上与土壤和活性污泥样品相比，均存在一定的异质性，微生物数量和种群分布也明显不同，所以建立简单易行并能最大限度反映池塘底泥微生物多样性的DNA提取方法成为亟待解决的问题，同时在研究中还需根据不同池塘底泥特点对DNA的提取和纯化方法加以优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法。

本发明采用了以下技术方案：

1.池塘底泥预处理：

①称取采集的池塘底泥样品1～5g置于离心管中，8000rpm室温离心3min，弃上清；

②向离心管中加入3倍体积20mmol/L EDTA缓冲液，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，并将此步骤重复一次；

③向离心管中加入PBS缓冲液5～15mL，该缓冲液按以下配比配制：NaCl 4g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄ 0.72g，KH₂PO₄ 0.12g，加ddH₂O至500mL，pH7.4，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，即样品预处理完毕；上述预处理后的样品用于后续分析；

2.粗提取池塘底泥总DNA：

①向预处理后的样品中加入0.8～3g酸洗石英砂，然后加入3～15mL的DNA提取缓冲液和10～50μL蛋白酶K 20mg/L，强力震荡5min混匀后，用摇床在37℃、225rpm条件下震荡20～30min；

②向上述样品中加入500～2000μL SDS缓冲液，于65℃水浴60～90min，每15min反复上下颠倒离心管3次，将样品摇匀；然后于8000rpm室温离心10mim，并将上清转移到干净的离心管中；

③向沉淀中加入1～5mL的DNA提取缓冲液和200～800μL SDS缓冲液，于65℃水浴10min，然后10000rpm室温离心10min，合并上清后，再重复一次；

④收集的上清中加入等体积的氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，收集上清；

⑤收集的上清中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，收集上清，抽提1～2次；

⑥收集的上清中加入1.5倍体积的冷乙醇和0.2倍体积的乙酸钠，漩涡震荡5min，-20℃放置2h；

⑦将步骤⑥处理后的样品于12000rpm室温离心10min，弃上清，并加入100～500μL 70％乙醇，摇匀后于40℃干燥；

⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50～200μL TE缓冲液，即得到底泥总DNA的粗提液；