[发明专利]一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法及其试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种扩增方法，具体地说，是关于一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法及其试剂盒。

【背景技术】

目前，多重连接依赖的探针扩增技术(Multiplex Ligation dependent ProbeAmplification，MLPA)是一项在科研与临床检验中广泛使用的中等通量的检测多个DNA位点的分子生物学技术。整体而言，MLPA是一种多重PCR的技术。能够同时探查多达50个基因组DNA位点的拷贝数目异常，最少甚至能区分一个核苷酸的序列差异。MLPA在反应中，设置50对左右的探针，每对探针特异性的检测一段靶序列，经过一次PCR反应，同时检测所有探针的剂量，并进而检测不同探针所对应靶序列的剂量(或拷贝数)。

与常规多重PCR不同，MLPA反应过程中，扩增的并不是靶序列，而是那些与靶序列复性杂交并被连接的探针。相对于常规的多重PCR，MLPA反应的PCR步骤仅需要一对通用引物。MLPA扩增的产物长度从100bp至500bp不等，可通过毛细管电泳进行区分。同时通过电泳结果中，不同条带的片段长度与峰值，可以判断出相应探针对应的检测位点的拷贝数变化。

MLPA整个试验过称可被分为5个步骤：1)DNA变性并与MLPA探针进行杂交；2)连接反应；3)PCR反应；4)PCR产物通过毛细管电泳分离；5)电泳结果进行数据处理。

MLPA针对每一个靶序列设计一对寡核苷酸探针，分别称为左、右探针。左探针的5’端为通用引物X，3’端为其与靶序列的杂交区。右探针的5’端为其与靶序列的杂交区，3’端为通用引物Y的互补区。左、右探针的杂交区在靶序列上紧密相连，而MLPA使用的连接酶只能连接杂交在同一序列并紧密相连的两段序列，因此，只有当相应的左右探针都正确杂交到相应的靶序列区时，连接反应中左右探针才能被连接。通用引物区与杂交区间可插入填充序列以调节探针序列总长。MLPA针对不同的靶序列设计的探针其杂交区与填充序列不同，但是都携带相同的通用引物区X与Y。通过填充序列的选择和调整，可使得不同的探针对总长各不相同，这样在后续的毛细管电泳中能根据长度不同进行分离。

在MLPA反应中，首先，模板DNA变性，并与MLPA探针混合孵育杂交过夜。在这个过程中，相应的探针与靶序列复性杂交。杂交完成后，加入连接酶，只有正确杂交的左右探针才能被连接。在接下来的PCR过程中，加入荧光标记的通用引物X、未加荧光标记的通用引物Y以及DNA多聚酶，那些未连接的探针因为只含一个通用引物区，在PCR过程中不能被扩增，也不会含有相应的荧光信号，而只有连接的探针才能够被扩增，所以探针连接产物的数量与模板DNA中靶序列的数量对应成正比。PCR扩增产物通过毛细管电泳分离。

这样，在一次MLPA反应中，可有多达50个靶序列被检测，用相关软件分析电泳结果，可知不同探针所检测的靶序列的缺失，扩增及拷贝数异常。MLPA作为一项简单、实用、稳定的中等通量DNA检测技术，被广泛应用于临床与科研中。

但是，由于MLPA技术的原理特点，MLPA技术仅能用于检测保守的、不具有多态性的DNA位点，并不能用于检测具有长度多态性的DNA位点，如短串联重复序列位点(short tandem repeats，STR)，这使得MLPA技术的进一步应用受到限制。同时，由于MLPA技术的探针中需要插入填充序列，在探针制作时，需要使用M13噬菌体培养，费时、复杂且成本较高。

STR广泛存在于人类和其他生物体基因组中。其核心序列一般为2-6bp，核心序列重复次数的不同形成了丰富的遗传多态性。由于STR遗传标记数量众多，杂合度高，特异且稳定，使得其成为目前遗传学分析最重要的遗传标记之一，被广泛应用于重组作图，群体遗传学和连锁分析中。尽管STR位点的应用如此广泛，目前其主要检测方法仍为单一STR位点的PCR检测，费时费力。由于STR存在重复序列，扩增相对较为困难，因此，目前尚没有一种技术能够灵活地针对多个STR位点进行分型。如果能够开发一种简单，快速，灵活的中等通量的STR分型检测技术，其应用前景将会非常广阔。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法。

本发明的再一的目的是，提供一种能够同时扩增与检测多个DNA位点试剂盒。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种多重连接与延伸依赖的探针扩增方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)DNA靶序列变性并与MLEPA探针进行杂交；

(2)延伸与连接反应；