[发明专利]一种以重组毕赤酵母高效发酵制备木聚糖酶的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种以重组毕赤酵母发酵制备木聚糖酶的改进工艺，属发酵工程领域。

背景技术

半纤维素在自然界中的含量占植物干重的35％，仅次于纤维素，是一种极其重要的可再生资源。木聚糖(Xylan)是植物半纤维素的主要成份，是除纤维素之外自然界中最为丰富的多糖，它存在于植物的细胞壁中以及植物体的几乎所有部位。木聚糖的结构变化范围很大，从仅由β-糖苷键连接的多聚木糖线性分子到具有高度分枝的异质多糖等多种结构，通常的木聚糖都含有2～4种不同的糖单体，包括85％～89％的D-木糖残基、少量的L-阿拉伯糖残基及微量的葡萄糖醛酸残基。为使木聚糖这一资源得以利用，必须将其进行降解，木聚糖酶(Xylanase)就是作用于木聚糖糖苷键的酶类。

广义上的木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要有三种：内切β-1，4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、外切β-1，4-木聚糖酶(EC3.2.1.92)和β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)。狭义上的木聚糖酶是指β-1，4-内切木聚糖酶。

木聚糖酶在饲料、造纸、食品等工业中有着极为广泛的应用前景。木聚糖酶本身是一种蛋白质，无毒无害，专一性强，反应条件温和。在饲料工业中，木聚糖酶可提高单胃动物的饲料(尤其是糠麸类、麦类)利用率，促进动物生长；在造纸工业中应用酶前处理工艺可以使木质素的提取变得更容易，同时保留纤维素成分，这样使得在随后的工艺中减少化学漂白剂的使用量，达到既环保又经济的目的；木聚糖酶应用于小麦食品，通过改善面团的持水性和面筋结构进而改善其品质，并延长其货价期。

现有采用重组毕酵母发酵法制备木聚糖酶的方法有在专利文献US5948667，US6586209，CN101067117A，CN1847400A，CN1693448A，CN1614015A，CN1924002A中有所介绍。重组毕赤酵母发酵制备木聚糖酶分为两个阶段：一是菌体生长阶段，二是外源基因的蛋白表达阶段。在菌体生长阶段，其目标是实现高细胞密度，由于培养基浓度过高往往抑制菌体的生长，因此又存在分批培养阶段和补料培养阶段。在分批培养阶段加入的培养基包括碳源、氮源、硫酸镁、硫酸钾、磷酸二氢钾、硫酸钙、氢氧化钾，在补料培养阶段再补入一定量的碳源。从整体上看，现有的方法均存在菌体生长阶段加入的培养基中盐类成分浓度过高及诱导阶段甲醇加入量过大，不仅会影响菌体的生长，而且也会增加木聚糖酶的生产成本以及环保治理的费用。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种以重组毕赤酵母高效发酵制备木聚糖酶的工艺，以克服现有木聚糖酶发酵制备技术中存在的甲醇加入量过大，木聚糖酶制备成本高的不足。

为了实现上述目的，本发明公开了一种以重组毕赤酵母高效发酵制备木聚糖酶的工艺，包括菌体分批发酵、补料发酵及外源基因的诱导表达阶段，其特征在于，在所说的分批发酵和补料发酵阶段中的培养基采用低盐配方，各组分的质量百分比为碳源3～6％、氮源1～3％、硫酸镁0.8～1.2％、硫酸钾0.5～1.0％，磷酸二氢钾0.2～0.5％；发酵温度为27～30℃，发酵pH为4.5～5.5，发酵时间为18～30h；所述外源基因的诱导表达阶段中，利用甲醇进行诱导，总诱导时间为110～140h，所说的甲醇诱导分为四个阶段：第一阶段为发酵时间的24h至60h，甲醇加入速率为每升培养液中每小时加入0.5～1.0毫升；第二阶段为发酵时间的60h至96h，甲醇加入速率为每升培养液中每小时加入1.0～1.5毫升；第三阶段为发酵时间的96h至120h，甲醇加入速率为每升培养液中每小时加入1.5～3.0毫升；第四发酵时间的120h至170h，甲醇加入速率为每升培养液中每小时加入3.0～4.5毫升。

与现有技术相比较，本发明的优点在于采用了低盐培养基配方进行重组毕赤酵母的菌体生长，以及在外源基因诱导过程中采用分阶段加入甲醇的工艺，使甲醇的加入量与菌体的生长量相匹配，减少了甲醇的加入量，从而实现达到制备成本更低廉，且所制备的木聚糖酶酶活更高。

下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式：

实施例1

所用菌株为Pichia pastoris 588，由中国农业科学研究院饲料研究所构建。