[发明专利]5’-RACE接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法

权利要求书

1.5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于5’-RACE接头序列按以下步骤添加：

一、根据目的基因设计目的基因特异性逆转录引物，根据目的基因所在物种基因组特征设计接头序列，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；

二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行逆转录，实现了5’-RACE接头序列添加。

2.根据权利要求1所述的5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于步骤一所设计的目的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点与该目的基因cDNA3’端接近。

3.根据权利要求1所述的5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于步骤一所设计的接头序列的3’末端设计有3个、4个、5个、6个、7个或8个连续的鸟嘌呤。

4.接头序列，适用于野生大豆(Glycine soja)的5’-RACE接头序列，其特征在于该5’-RACE  接头序列为5’-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGCTCGGGG-3’。

5.5’端未知基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于5’端未知基因完整编码序列按以下步骤进行扩增：

一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性巢式PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；

二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行逆转录，获得3’端添加了接头序列的单链cDNA片段；

三、以3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；

四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列；其中步骤一所设计的巢式锚定引物在目的基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。

6.根据权利要求5所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的目的基因特异性的巢式PCR引物与cDNA的结合位点与该目的基因cDNA3’端接近。

7.根据权利要求5所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的接头序列长度大于40bp。

8.根据权利要求5、6或7所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的巢式锚定引物为2～10条；步骤一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物为2～4条。

9.根据权利要求8所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物之间的Tm值相差小于1℃。

10.根据权利要求5、6、7或9所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤四中验证采用以下步骤：将步骤三巢式PCR扩增片段的测序结果与目的基因中已知序列进行拼接，然后将拼接得到的序列进行比对和完整性分析，再在拼接所得序列两端设计引物，通过PCR确认拼接结果。