[发明专利]重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗瘤坏死因子的单克隆抗体及其应用。

背景技术

自身免疫性疾病是威胁人类健康的慢性病，由于类风湿关节炎和强直性脊柱炎等病致残的人数超出交通事故。

早期用于治疗类风湿性关节炎症状以及维持患者生活质量的药物为非甾体类抗炎药，比如阿司匹林、奈普生和COX-2抑制剂，这些药物都可以缓解疼痛和炎症反应。甾体激素也和非甾体类抗炎药联合使用已进一步减轻炎症反应，这种联合治疗可以获得更强的短期抗炎效果，但这种效果随着时间推移而逐渐减少直至消失。

另一类治疗类风湿性关节炎的药物称为DMARDS(disease-modifying antirheumatic drugs)，这一类药物不仅是缓解症状，而且可以阻断疾病的发展进程。最常使用的药物为甲氨喋呤，其他药物包括金盐、抗疟药、柳氮磺胺呲啶(Sulphasalazine)、四环素和环孢素。

尽管甲氨喋呤对大多数类风湿性关节炎病人都有效，但许多病人无法耐受该药的副作用，大约50％的病人最终会停止使用该药。这些病人可以使用一些比较新的生物反应调节剂，如来氟米特(Leflunomide，Arava)，但其作用机制和不良反应与甲氨喋呤类似，作为二线治疗药物用于甲氨喋呤无法耐受或治疗失败的患者。

上述提及的都属于使用多年的老药，疗效确切，使用量大，但由于为非专利药，价格低廉，因此销售额并不高。近几年开发成功一系列免疫调节剂，这些免疫调节剂属专利药，价格高，为开发厂家带来了巨额利润。最成功的当属肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂，大约30％中到重度类风湿性关节炎患者会接受TNF抑制剂治疗，并且还将往轻到中度患者群渗透。

本发明以人TNF重组蛋白为抗原免疫小鼠，成功获得多株杂交瘤，能够分泌中和TNF生物活性的单克隆抗体，其中一株亲和力达到3nM，生物活性EC50为0.6nM。这个抗体已足以作为我们抗体药物的前体，目前人源化步骤已完成。

发明内容

本发明的一个目的是提供分泌特异性结合人肿瘤坏死因子的单克隆抗体。

本发明所提供的抗体可以为如下1)、2)所述的抗体：

1)一种抗体，其重链可变区具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列，其轻链可变区具有序列表中序列3所示的氨基酸残基序列。

2)由重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10分泌得到的单克隆抗体。

上述1)中所述抗体的重链可变区的编码基因和轻链可变区的编码基因也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种分泌特异性结合人肿瘤坏死因子α的单克隆抗体的细胞系。

实验证明重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10分泌的单克隆抗体人TNFα的解离常数为3nM，生物活性EC50为0.6nM。

上述单克隆抗体能够高亲和力特异性识别肿瘤坏死因子，并中和其生物学活性，可以用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫性疾病。

附图说明

图1为ELISA检测杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体与人TNFα的解离曲线(纵坐标是ELISA显色后的光吸收值)

图2为杂交瘤细胞株3f8生物活性的测定。

具体实施方式

下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。

实施例1、鼠杂交瘤3f8及其分泌的抗肿瘤坏死因子α(TNFα)的单克隆抗体的制备和鉴定

一、杂交瘤细胞株鼠杂交瘤3f8的制备

1、抗原的制备：

人TNFα与结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MT)Psts-1蛋白氨基酸326-344小肽(DQVHFQPLPPAVVKLSDAL)的融合蛋白(TNFα-MT)的获得：将编码人TNFα的cDNA与小肽通过PCR方法重组，得到融合基因TNFα-MT；将融合基因克隆至删除了GST编码区的PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达，得到融合蛋白TNFα。融合蛋白中带有6×his Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。

2、免疫：