[发明专利]用原核表达系统制备铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于医学研究领域，特别涉及一种用原核表达系统制备铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF的方法。

(二)背景技术

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，其导致的感染占革兰阴性感染的10％，常继发于肿瘤、大面积创伤、烧伤及使用免疫抑制剂等机体免疫力低下患者，感染类型多样，可侵害呼吸道、消化道、泌尿系统、骨髓和皮肤等。

关于铜绿假单胞菌的检测，目前实验室多用传统的细菌培养方法。随着免疫学方法的快速发展，如何用抗原抗体的特异性反应快速有效的检测铜绿假单胞菌感染，已被研究人员广泛关注。

铜绿假单胞菌含有两种主要的抗原性细胞外膜成分：脂多糖类和外膜蛋白。OprF及其抗体可以作为免疫预防和快速检测的工具，是因为它具有以下优点：1.暴露于菌体表面，具有较高的免疫原性；2.在遗传上具有较高的保守性，其疫苗可与17种不同的血清型铜绿假单胞菌具有较好的交叉免疫性。

在20多种铜绿假单胞菌外膜蛋白中，OprF是免疫原性较强的一种。已有研究证明，OprF羧基端暴露于菌体表面，抗原决定簇较多，免疫原性更强。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种特异性高、检测速度快的用原核表达系统制备铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用原核表达系统制备铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF的方法，主要包括如下步骤：

(1)从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，通过PRC(聚合酶链式反应)扩增OprF羧基端，并将其克隆至原核表达载体pET28b中，构建重组表达载体pET28b-OprF；

(2)重组质粒经酶切和序列测定后，转化E.coli BL21，IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达，进行SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)检测；

(3)经Ni-NTA亲和层析柱纯化后得到元和表达的OprF蛋白。

所述扩增OprF羧基端采用的引物为上游引物5’-TCGAAGCTTGCTCCGGCTCCGGAAC CGGTTGCCG AC-3’(HindIII)和下游引物5’-ACCTCGAGTTCAA CGCGACGGTT GA AGCGCG-3’(XholI)。

本发明利用原核表达系统构建并表达OprF蛋白，为今后采用杂交瘤技术获得OprF特异性单克隆抗体或免疫动物获得多价特异性抗血清，通过胶体金免疫层析技术达到对铜绿假单胞菌的快速筛查检测奠定研究基础。

(四)附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明pET28b-OprF载体的示意图；

图2为pET28b-OprF载体中OprF的测序结果。

(五)具体实施方式

实施例：

用细菌基因组提取试剂盒提取铜绿假单胞菌基因组DNA，以此为目的基因PCR扩增模板，根据GenBank公布的铜绿假单胞菌OprF基因核苷酸序列(NC_002516)，设计引物：上游引物5’-TCGAAGCTTGCTCCGGCTCCGGAAC CGGTTGCCG AC-3’(HindIII)和下游引物5’-ACCTCGAGTTCAA CGCGACGGTT GA AGCGCG-3’(XholI)。扩增的目的基因OprF片段大小为470bp左右，编码约140个氨基酸的肽段(190-342aa OprF)。OprF片段与克隆载体pMD19simple-T连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含有氨苄/X-Gal/IPTG的LB琼脂平板筛选，用蓝白斑法筛选阳性克隆。

将验证正确的含pMD19simple-T-OprF重组质粒的菌株中提取质粒DNA，并进行HindIII和XholI双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，与用相同处理的pET28b质粒连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB平板，用PCR和酶切鉴定阳性克隆子，将阳性克隆扩增提取质粒后转化BL21感受态细胞。

测序正确的阳性克隆转化E.coli BL21，1mMIPTG在37℃条件下诱导表达OprF蛋白，用SDS-PAGE电泳和western-blot进行验证。