[发明专利]一种麝香抗炎活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于中药活性参数检测技术领域，具体是涉及一种麝香抗炎活性检测方法的技术。

背景技术

麝香作为中药具有开窍醒神、消肿止痛、活血调经的功效，临床上广泛用于治疗疮疡肿毒，咽喉肿痛、跌打损伤等症，抗炎作用被认为是麝香的主要药理活性之一。

现有技术在检验中药抗炎活性时，通常采用的药理实验方法是整体动物实验法，该方法首先通过一些炎症介质致使动物某些部位发生炎症，然后对该炎症部位使用不同抗炎药物进行对比实现，根据炎症部位的重量、体积等变化判断药物的抗炎活性强度，如小鼠耳肿胀、大鼠足肿胀实验法等。一般来说，上述整体动物实验法难以给出精确地量化评价，操作步骤复杂，费用高，干扰因素多，作为麝香的生物效价检测方法具有一定局限性。

已有药物分析中发现，环氧酶(COX)是花生四烯酸(AA)代谢过程中重要的限速酶之一，COX有两中结构型，即COX-1和COX-2，通过抑制COX可以减轻炎症反应、从而实现抑制炎症的发展。因此，COX途径是抗炎药物发挥作用的重要途径之一，然而由于COX-1选择性不强，药物对其抑制往往产生许多副作用；相比之下，特异性地抑制COX-2的功能逐渐成为研究开发抗炎药物的目标。

发明内容

本发明的目的是为了解决已有整体动物实验法检测中药抗炎活性时，检测结果不能定量，成本高，操作步骤复杂的缺陷，利用抗炎中药对COX-2活性抑制强度可以表征待测品抗炎活性原理，提供了一种测定麝香抗炎活性的方法。

实现上述目的本发明的技术方案为，一种麝香抗炎活性的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)取麝香提取、提取液配制成不同浓度的溶液为待测品A；

(2)配制系列浓度的前列腺素(PG)标准品溶液B；

(3)配制系列浓度的的阿司匹林溶液作为阳性对照品C；

(4)分别配制背景组，环氧酶II(COX-2)100％初始活性组，阳性对照组及麝香供试品组4种反应体系组；

(5)进行环氧酶II(COX-2)反应步骤：即取上述步骤(4)所制得的四组反应液，混匀，37℃水浴孵育10～20min；孵育后的四组反应液中均加入10μl花生四烯酸，混匀，37℃水浴孵育2min；

(6)取步骤(5)中经COX-2反应的四组反应液，加入1M HCl 50μl，停止水浴，每组均加入100μl饱和SnCl2溶液，混匀，室温放置5min；

(7)将步骤(6)所得的四组反应液分别稀释；

(8)将步骤(7)获得的一系列前列腺素供试品，采用试剂盒，通过酶免疫法，测定各组反应液吸收度值，并以PG标准品溶液B得到的吸收度标准曲线计算各组反应液中前列腺素的含量，供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别为C_D，C_E，C_F，C_G；

(9)根据供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别计算阳性对照组抑制率和麝香供试品组抑制率；

(10)根据(9)步得到的阳性对照组抑制率和麝香供试品组抑制率，采用“二剂量”法对麝香供试品组抑制率进行可靠性检验，从而确定麝香抗炎活性效价。

步骤(1)中的溶剂通常采用强极性溶剂，可以选自水、甲醇、乙醇中的一种或两种以上的混合物，不同浓度待测品A的方法是以20-100倍麝香样品量的强极性溶剂进行分步提取10-60分钟，滤过，收集滤液；或以20-100倍麝香样品量的强极性溶剂静置提取30分钟后超声10分钟。

步骤(1)、(2)、(3)中的待测品A浓度为大于0％小于100％，前列腺素(PG)标准品溶液B对数浓度为3.3、3、2.7、2.4、2.1、1.8、1.5、1.2及阳性对照品C的浓度为大于0％小于80％。

步骤(4)中4种反应体系组的配置方法为：

背景组：反应缓冲液+经高温灭活的COX-2+抗氧剂，体积比为97∶1∶1；

COX-2100％初始活性组：反应缓冲液+COX-2+抗氧剂，体积比为97∶1∶1；

阳性对照组：反应缓冲液+COX-2+抗氧剂+阳性对照C，体积比为95∶1∶1∶2；

麝香供试品组：反应缓冲液+COX-2+抗氧剂+待测品A，体积比为95∶1∶1∶2；

其中，反应缓冲液的配制为：Tris-HCl+EDTA+苯酚，并调节pH至8.0，质量比为1.6∶0.15∶0.02。