[发明专利]一种寡核苷酸“直接缩合法”试剂及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸“直接缩合法”合成用试剂的结构及其制备方法，该结构为包含一个亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯结构，该试剂可在固相载体表面羟基基团或氨基基团上高效快速的连接核苷，进一步用于寡核苷酸的合成。

背景技术

寡核苷酸是现代分子生物学研究中一类重要的研究手段，从诊断探针法到PCR到基因表达的抑制作用，其在技术上被广泛应用，寡核苷酸的广泛使用使得寡核苷酸高效廉价合成方法的需求快速增长。反义寡核苷酸和用于诊断试剂研究用的引物等的合成目前已经很常规。早期合成方法包括磷酸二酯(Khorana et al，J Molec Biol，1972；72：209)和磷酸三酯(Reese，Tetrahedron Lett，1978；34：3143-3179)化学合成，这些早期的方法为亚磷酰胺和H-磷酸酯等化合物用于寡核苷酸的合成奠定了基础。之后，Beaucage和Caruthers(Tetrahedron Lett，1981；22：1859-1862)采用亚磷酰胺合成脱氧寡核苷酸，Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett，1987；28：3539-3542)采用亚磷酰胺合成甲基膦酸酯寡核苷酸，Connolly等(Biochemistry，1984；23：3443)采用亚磷酰胺合成硫代磷酸酯寡核苷酸。Jager等(Biochemistry，1988；27：7237)采用亚磷酰胺合成磷酸酰胺寡核苷酸，Agrawal等(Proc Natl Acad Sci USA，1988；85：7079-7083)采用H-磷酸酯化合物合成磷酸酰胺寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸。

采用亚磷酰胺方法固相合成寡核苷酸是大多数实验室选择的方法，起始物质是与固相载体相连的核苷，它将成为核苷酸的3’羟基末端，然后依次将后一个核苷单体的活性3’磷酸基团连接到前一个核苷酸的5’羟基上，每合成上去一个核苷单体均包括脱保护-偶联-氧化/硫化-封闭四步，如此循环直至完成全部序列长度。由于合成的寡核苷酸链始终连接在固相载体上，液相中过量的试剂可以过滤除去，因此每步合成循环间不需要进行纯化(Matteucci andCaruthers，J Amer Chem Soc，1981；103：3185)。当链合成完毕，粗品寡核苷酸还需要从载体上切割下来，并脱掉保护。目前有多种固相载体用于寡核苷酸的固相合成，最常用的是控制孔径玻璃(Controlled Pore Glass，CPG)珠(Adams et al，J Amer Chem Soc，1983；105：661)和聚苯乙烯树脂(McCollum andAndrus，Tetrahedron Lett，1991；32：4069)，其中树脂载体比CPG在氨水条件下进行寡核苷酸的切割和脱保护时更为稳定。

固相合成时多采用核苷3’位羟基连接的琥珀酸酯作为碱切割的位点，该琥珀酸酯键对碱不稳定，用氨可以从载体上切去，合成完成后，寡核苷酸被定量切下，保留一个游离的3’羟基。而琥珀酸与固体载体表面羟基的酯化反应则比较困难，产率低，而且该反应需要在高温下反应很长时间。为了提高载量，所使用的CPG通常采用氨基硅烷化试剂处理，即将一个氨基烷基链通过硅氧烷键连接到其表面，可以增强反应基团的柔性，减小空间位阻；而聚苯乙烯通常采用氨基甲基连接臂连接到其表面，核苷3’位羟基连接的琥珀酸羧基可以共价结合到载体的氨基基团上。但琥珀酸羧基与氨基的缩合依然需要在高温下反应过夜。

而本发明提出的采用包含亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯，即“直接缩合法”试剂，在固相载体表面羟基或氨基基团上连接核苷的方法，反应条件温和，反应时间短，可以实现高载量，同时合成的寡核苷酸纯度和产率均较高。与CPG载体合成效果相比，采用羟基树脂进行合成时，寡核苷酸合成载量和产率明显高于采用CPG合成的产品，并且采用羟基树脂合成的寡核苷酸n-1杂质明显低于采用氨基树脂合成的产品，而后者又明显低于采用CPG合成的产品。

发明内容

本发明的目的在于利用化学合成方法提供一种能使固相载体表面羟基基团上快速高效连接核苷的新结构，该结构包含一个亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯，采用该试剂进行的“直接缩合法”可提高寡核苷酸固相合成效率。

根据本发明，上述“直接缩合法”试剂的结构通式为

式中R为H时，结构为β-D-呋喃脱氧核苷，R为OH时，结构为β-D-呋喃核苷；B为碱基，选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)；n取值为2、3、6或12。