[发明专利]亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法无效
| 申请号： | 201010186100.X | 申请日： | 2010-05-28 |
| 公开（公告）号： | CN101914615A | 公开（公告）日： | 2010-12-15 |
| 发明（设计）人： | 张风丽;李志勇 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12R1/89 |
| 代理公司： | 上海交达专利事务所 31201 | 代理人： | 毛翠莹 |
| 地址： | 200240 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 亚历山大 荧光 定量 聚合 反应 标准 构建 方法 | ||
1.一种亚历山大藻荧光定量聚合酶链反应标准品的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)对培养的亚历山大藻细胞计数，提取亚历山大藻A.catenella ACDH01的DNA，并测定DNA在260nm的吸光值；
2)以提取的A.catenella ACDH01的DNA为模板，以18S rDNA序列5‘-CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG-3’和28S rDNA序列5‘-GGAGGGACCAGCTACTA-3’为引物，聚合酶链式反应扩增18S rDNA-28S rDNA区的片段；扩增的1600bp片段与pEASY-Blunt Simple载体连接成重组质粒，将重组质粒转化宿主菌Trans1-T1，提取宿主菌Trans1-T1内重组质粒，经聚合酶链式反应鉴定及测序分析确认；
3)检测经确认的重组质粒260nm吸光值，确定重组质粒的原液拷贝浓度，并将重组质粒原液稀释，得到梯度浓度为107-102copies/mL数量级的real-time聚合酶链式反应重组质粒标准品；
4)以重组质粒标准品为模板，以
5.8S-b5’：5‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3’和
5.8S-b3’：5‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3’
为引物，进行real-time聚合酶链式反应，根据反应中的临界循环数以及重组质粒标准品的梯度浓度对数值，制作real-time聚合酶链式反应标准曲线。
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