[发明专利]一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子酶工程学与生物技术，具体涉及一种高活力脂肪酶的编码基因，同时涉及该突变基因编码的脂肪酶蛋白的制备方法。高酶活脂肪酶突变株蛋白可以广泛应用于食品、化工和医药等行业。

背景技术

脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)是催化油脂水解的一类酶的总称。按照国际生化联合会的原则，它的系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，习惯称为脂肪酶。脂肪酶在动植物的各种组织及微生物中普遍存在，是生物体内脂代谢不可缺少的重要水解酶。脂肪酶属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶的催化遵循丝氨酸水解酶的反应机制，能够在油水界面上将甘油三酯完全水解成脂肪酸和甘油，因而脂肪酶能够催化脂水解、脂合成和脂交换等多种反应，被应用于油脂处理、洗涤剂、食品加工、精细化工、制药、造纸等多种行业。

脂肪酶是研究得最早的酶类之一。人们于1834年首先在动物胰脏发现脂肪酶的活性，至今已有近二百年的历史。1871年报道了植物种子脂肪酶，而上世纪初人们从微生物中也发现了脂肪酶。由于微生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广的反应pH值、反应温度以及对底物的反应专一性，又便于进行工业化生产和获得高纯度的酶制剂，再加上微生物脂肪酶在理论研究和实际应用中都非常重要，因此它们在研究和应用上的进展相当迅速。产脂肪酶的微生物种类很多，遍及细菌、酵母及霉菌各大类中，迄今已经报道的65个属中，细菌28个属，放线菌4个属，酵母菌10个属，其它真菌23个属。迄今为止，黑曲霉、白地霉、毛霉、荧光假单胞菌等所产生的脂肪酶已经相继获得结晶。其它如无根根霉、圆柱形假丝酵母、耶尔氏球拟酵母、粘质色杆菌等来源的脂肪酶也相继得到高度提纯，并对它们的理化性质开展了进一步的研究。

尽管产脂肪酶微生物容易发现，但寻找适合于工业规模生产的脂肪酶产生菌及其发酵条件却非常困难。在通过传统诱变育种以及优化发酵条件提高脂肪酶产量方面已经开展了大量的工作，并使得许多脂肪酶实现了工业化生产。近年来随着基因操作技术的深入发展和应用，人们能够越来越多的通过直接对酶基因的改造，获得更适合于生产实践需求的脂肪酶制剂。在众多的脂肪酶中，枯草杆菌脂肪酶Lip A作为一种细菌来源的脂肪酶，具备许多优良的性质，如分子量小，催化活力高，底物范围广，是一种嗜碱性脂肪酶等，因此其具有较好的食品工业及化学工业等方面的应用潜力。但是，由于枯草杆菌脂肪酶高浓度时容易聚集，给其纯化和应用带来很大困难，所以通过改造Lip A，得到高酶活突变株，使其在低浓度范围就具有高催化活性，具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的编码基因LipA(R33W/L140F)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变酶，该突变酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。通过重叠PCR引入突变，连接于表达载体，获得高活力脂肪酶产生菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-Lip A f₁₂-C₂(R33W/L140F)，生产高活力突变体脂肪酶。该突变酶的酶活是野生型的四倍。

本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶的制备方法，该方法是构建大肠杆菌表达系统，利用亲和层析方法纯化高酶活脂肪酶突变株蛋白。该方法简便，成本低廉。

本发明的再一个目的是在于提供了一种高酶活脂肪酶突变株蛋白在皮革加工工业中的应用。在皮革加工中的浸水和/或浸灰工艺中添加该蛋白可以水解并分散皮革中的脂肪，使油脂分子变小、水溶性增强而达到皮革脱脂的目的。本发明提供的突变体蛋白对不同碳链长度的底物的催化活性是野生型的4倍以上，应用于皮革脱脂时，在保证相同催化功效的前提下，与野生型酶制剂相比可以有效减少酶制剂的使用量，不但可以节约成本，同时可以避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催化效率的问题，提高皮革的脱脂效果。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：

本发明的第一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高酶活脂肪酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征是在于野生型脂肪酶结构基因上具有97位的C突变为T(R33W)，420位的A突变为T(L140F)的点突变。一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的制备方法，其步骤是：

1.突变脂肪酶LipA(R33W/L140F)突变点的引入：