[发明专利]一种适合三种宿主系统的表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达技术，具体地涉及一种表达载体，尤其涉及一种可用于大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞三种宿主系统的表达载体。

背景技术

随着生物医药领域研究和产业的迅猛发展，对于重组蛋白的需求越来越多。不同的重组蛋白在不同的表达宿主中的表达量，纯化难度以及活性有很大的差别。为了得到高表达，高活性的重组蛋白，常常需要在不同的表达系统进行尝试。由于不同的表达系统使用的不同表达元件(如启动子等)，进行尝试时通常需要克隆到宿主特定的表达载体中，工作量和成本都比较高，耗时长。因此，一种适合于多个表达系统的载体，对于重组蛋白的生产具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种适合三种宿主系统的表达载体，其可用于大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞表达重组蛋白，其使得表达系统特异的表达载体不再必需，大大降低表达载体构建的成本，缩短获得重组蛋白的时间。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供的一种适合三种宿主系统的表达载体，含有大肠杆菌，昆虫细胞和哺乳动物细胞表达元件，将重组蛋白编码序列克隆至此载体，能在上述三种宿主系统中表达重组蛋白；该表达载体还含有bacmid穿梭质粒转座特异元件。

所述哺乳动物细胞表达元件含有一个启动子，可以是各种常用的启动子，如SV40启动子，小鼠甘油磷酸激酶启动子，beta-actin启动子，人泛肽启动子，人EF-1启动子，人巨细胞病毒早期启动子，优选使用的启动子是经改进的人巨细胞病毒早期启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示。为了增强在哺乳动物细胞中的表达，一个内含子序列被插入上述启动子的下游。优选使用的内含子如SEQID NO.2所示。

在哺乳动物细胞启动子的下游，含有一个大肠杆菌系统所用的启动子，可以是各种常用的启动子如Tac，T7，Trp等，优选使用的启动子是T7lac，如SEQID NO.3所示。

在哺乳动物细胞启动子的下游，还含有一个昆虫细胞杆状病毒表达系统所用的启动子，这个启动子可以是Polyhedrin promoter，p10 gp64，p6.9等常用的启动子，优选使用的启动子是Polyhedrin promoter，如SEQ ID NO.4所示，这个启动子可以位于大肠杆菌启动子的上游或者下游，优选地，位于大肠杆菌启动子的下游，如SEQ ID NO.5所示。

大肠杆菌启动子和昆虫细胞杆状病毒表达启动子可位于内含子上游，或者下游，或者包含于内含子之内，优选地位于内含子中，如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的表达载体还可以含有一个病毒复制起点，这一复制起点可以在带有反式复制因子的哺乳动物细胞中复制，使得质粒在细胞中的存续时间延长，细胞培养后2个月仍能检测到质粒的存在和重组蛋白的表达。可用复制系统有SV40，EBV，BKV复制起点和反式元件，优先选用EBV OriP复制起点(SEQ IDNO.6)和含有EBNA-1蛋白的哺乳动物细胞。

本发明提供的表达载体含有与bacmid穿梭质粒转座特异的位点，优选地使用Tn7R(SEQ ID NO.7)和和Tn7L(SEQ ID NO.8)。

本发明提供的表达载体在大肠杆菌中进行表达时，采用质粒直接转化的方法，使用IPTG或半乳糖进行诱导表达。优选的使用BL21菌株。

本发明提供的表达载体在昆虫细胞中进行表达时，首先要将其与bacmid穿梭质粒进行转座，将表达框架转座到bacmid上，获得的bacmid转染昆虫细胞获得杆状病毒，病毒感染昆虫细胞表达重组蛋白，优选的使用昆虫细胞sf9。

本发明提供的表达载体在哺乳动物细胞中进行表达时，可使用上述昆虫杆状病毒感染哺乳动物细胞，该病毒感染后不能产生新的病毒。但由于EBV OriP复制起点(OriP)的存在，病毒DNA可以以附加体的形式进行复制。表达质粒也可以以瞬时转染的形式表达重组蛋白，由于OriP的存在，质粒也可以以附加体的形式进行复制。优选的使用细胞293-EBNA。

本发明优选的表达载体为载体pNP3P，其序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的有益效果在于，提供一种适合大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞三种宿主系统表达载体，其可用于大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞表达重组蛋白，该表达载体质粒可应用于重组蛋白表达，快速筛选合适的表达宿主，以及随后的重组蛋白的大量表达与制备。本发明使得表达系统特异的表达载体不再必需，大大降低表达载体构建的工作量和成本，缩短获得重组蛋白的时间。

附图说明

图1是本发明实施例中使用的表达载体示意图；