[发明专利]一种1, 4-β-D-木聚糖酶突变体

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及耐热性提高的1, 4-β-D-木聚糖酶突变体。

背景技术

木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanases，EC 3.2.1.8)以内切方式水解木聚糖分子中的 b-1, 4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖，是半纤维素水解酶系中最关键的水解酶之一，在工业上具有重要的应用价值。自上世纪80年代木聚糖酶开始工业应用以来，木聚糖酶的应用领域不断扩大，目前已经在饲料、制浆造纸、食品、能源等行业中得到广泛应用。随着木聚糖酶的应用范围进一步拓展，工业上对其现有性能提出了更高的要求，如长时间内保持活性稳定，在极端环境中保持高的活性(极端温度或者pH值等)或者可以接受不同的底物(包括非天然底物)。其中酶的热稳定性对于工业应用来说十分重要，而且高温条件下，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，节约成本，也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。

随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技术成功的改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展（Zhao, 2007，Biotechnogy and Bioengineering 98(2),271-275）。其中易错PCR(error-prone PCR)、DNA改组(DNA shuffling)、半理性设计等已成为酶的分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白质的进化过程(Lehmann and Wyss, 2001 Current Opinion in Biotechnology 12(4), 371-375 )。

发明内容

本发明的目的在于采用定向进化技术同时结合基于序列比对的半理性设计方法对来源于Geobacillus stearothermophilus的1, 4-β-D-木聚糖酶XT6进行分子改造，获得热稳定性提高的木聚糖酶突变体。

为达到上述目的，本发明使用多轮易错PCR方法、DNA 改组技术对1,4-β-D-木聚糖酶XT6基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，同时使用半理性设计方法确定部分潜在热稳定相关位点，再通过定点突变方法得到热稳定相关突变体。

本发明的具体实施方法为：来源于G. stearothermophilus（Genbank登录号为：Z29080）的木聚糖酶XT6由379个氨基酸组成(Lapidot, Mechaly et al., 1996 Journal of Biotechnogy 51(3), 259-264)（见SEQ ID NO.1）。为迅速得到XT6全基因序列并提高其在大肠杆菌中的表达量，以利于对XT6酶分子的改造，根据已报道的XT6基因序列信息(Gat, Lapidot et al., 1994 Applied and Environmental Microbiology 60(6), 1889-1896)，采用基于PCR的全基因合成方法合成了木聚糖酶XT6全基因序列。同时根据大肠杆菌密码子偏好性对其DNA序列进行优化（在线软件DNAWorks，http: //helixweb.nih.gov/dnaworks/，优化合成的的木聚糖酶XT6基因序列为SEQ ID NO.2），功能正常的酶蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中过量表达Zhang, Pei et al., 2009 Chinese Journal of Applied and Environmental Biology 15(2), 271-275)。采用易错PCR方法、DNA 改组技术对其进行随机突变，以pET 28a (+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主E.coli BL21-DE3中，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。离心重悬后，取部分菌液加入1%浓度木聚糖底物反应适当时间后，以DNS法终止反应，测定酶活性。同时，另取部分菌液热处理一定时间，测定残余活性。残余活性高于对照的菌株转接到新的96孔培养板中，进行重复筛选。将筛选得到的残余活性高于对照的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体DNA序列信息。详细方案见实施例2。