[发明专利]一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用

权利要求书

1.一种DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.包含权利要求1所述DNA分子的表达载体。

3.包含权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述表达载体的工程菌。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的原始菌株是具有高腈水合酶酶活、并利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的原始菌株是红球菌(Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是具有高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌：赤红球菌(Rhodococcus ruber)TH-5(amdA-)/pNV18A^M CGMCC No.3725。

7.一种权利要求3、4、5或6所述工程菌的构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)以PS772和PS1670为引物，以高产腈水合酶的红球菌的基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应；所述上游引物PS772的碱基序列如SEQ ID No：3所示；所述下游引物PS1670的碱基序列如SEQ ID No：4所示；再通过热不对称基因扩增方法获得sigma 70因子全长sigA基因及其上游序列，其碱基序列如SEQ IDNo：2所示；所述热不对称基因扩增方法所用三个嵌套引物分别为sigA5sp1、sigA5sp2、sigA5sp3，其碱基序列依次如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7所示；所述热不对称基因扩增方法所用四个简并引物依次为AD1、AD2、AD3、AD4，其碱基序列分别为SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ IDNo：11，序列中N指A、T、G、C任意一种碱基，I指次黄嘌呤；

(2)将目标sigA基因及其上游序列与红球菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行EcoRI和HindIII双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4DNA连接酶将两种酶切产物在3～5℃条件下进行连接反应14～16h，得到连接产物；

(3)将连接产物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，挑选阳性克隆，进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得到带有sigA基因及上游序列的重组质粒；

(4)采用商用随机突变试剂盒构建sigA基因随机突变质粒文库；

(5)将步骤(4)所得随机突变质粒文库以电穿孔转化法转入原始菌株中，采用含有卡那霉素及致死浓度4～6mg/mL的丙烯酰胺的LB平板上筛选重组菌株，获得高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的工程菌。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述高产腈水合酶的红球菌是红球菌(Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述红球菌-大肠杆菌穿梭质粒是pNV18、pPHU281、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒。

10.权利要求6所述高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺中的应用。