[发明专利]微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用。

背景技术

隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是一种世界性分布的人兽共患寄生虫病，该病在免疫功能正常的机体中，可引起自限性腹泻；在免疫功能缺陷患者如艾滋病（AIDS）病人中，可导致严重甚至威胁生命的疾病。该病已被列为世界最常见的6种腹泻病之一，并被世界卫生组织和美国疾病控制与预防中心列入新发传染病。目前对该病尚无特效药物，绝大多数抗生素、抗寄生虫药物均无效，因此隐孢子虫病的免疫预防和治疗就显得愈发重要。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常在重组疫苗中编码一个全长的隐孢子虫抗原蛋白。但是，此类单一的疫苗候选分子的免疫保护效果并不理想，其原因可能是隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期，导致单一抗原、单一表位的免疫保护效果不够理想。考虑使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际寄生虫学界开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原表位预测，构建多表位疫苗（multi-epitopevaccine），来预防和控制寄生虫病，并取得了阶段性成果，尤其在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果，其中不少已进入Ⅱ期或Ⅲ期临床试验。在隐孢子虫领域目前尚无这方面的报道。

多数研究结果显示，CD4⁺辅助性T细胞（helperTcell,Th）在抗隐孢子虫感染中发挥着极其重要的作用。Aguirre观察到主要组织相容性复合体Ⅱ（majorhistocompatibilitycomplexⅡ，MHCⅡ）类分子缺失导致缺乏CD4⁺T细胞的小鼠很难控制微小隐孢子虫（Cryptos-poridiumparvum）感染；陈淑兰等检测隐孢子虫病患者外周血中CD4⁺T细胞及CD4/CD8细胞比值，发现CD4⁺T细胞极显著低于正常对照组，而CD8⁺T细胞反而升高，致使CD4/CD8比值显著降低；Ungar曾报道选择性地耗竭辅助性T细胞（CD4⁺T细胞）会延长小鼠隐孢子虫感染，证明CD4⁺T细胞对于机体清除隐孢子虫感染至关重要。在对人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）阳性病人的研究中也进一步证实了抗隐孢子虫感染中CD4⁺T细胞的必要性。Flanigan认为艾滋病增加了患者对微小隐孢子虫的易感性，最严重的情况通常见于CD4⁺T细胞数量最少的个体；Riggs也证实在艾滋病患者或别的细胞免疫缺陷患者，控制微小隐孢子虫感染的能力和CD4⁺T细胞数量直接相关；Schmidt等用高效抗逆转录病毒疗法治疗伴有微小隐孢子虫感染的HIV阳性病人时，发现血循环和粘膜中CD4⁺T细胞增加，粘膜中CD4⁺T细胞增加的更多并达到更高水平。

鉴于CD4⁺ T细胞在隐孢子虫感染中的重要作用，对隐孢子虫Th表位进行研究具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决缺少隐孢子虫多表位疫苗的技术问题，提供一种微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白，该Th多表位基因和融合蛋白可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

此外，还需要提供一种微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白，其包含：SEQIDNO.1～10所示Th表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。

优选的，所述Th表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。在各个Th表位序列之间加入柔性氨基酸组成的接头序列，能使各个Th抗原表位在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC（主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用）分子的结合；同时在各个Th表位之间用接头序列连接，可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。

更优选的，所述融合蛋白具有SEQIDNO.11所示的氨基酸序列。