[发明专利]金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白在大肠杆菌中的表达及应用

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一个金黄色葡萄球菌SasA基因及其编码蛋白以及作为亚单位疫苗在金黄色葡萄球菌感染预防方面的应用。 

技术背景：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的革兰氏阳性条件致病菌，最常见的金黄色葡萄球菌引发的感染是局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心脏内膜炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。大面积烧伤、需进行血液透析的患者、早产儿及其他免疫力低下的人群是金黄色葡萄球菌的易感人群。国内一项研究结果表明，烧伤面积大于30％者，40％并发金黄色葡萄球菌引起的脓毒症，其中20％的患者最终转为多器官功能障碍综合症，50％以上死亡。另据报道75％的早产儿脓毒症是由金黄色葡萄球菌引起的。金黄色葡萄球菌感染的经典治疗是使用抗生素，而多种抗生素抗性菌株的出现，特别是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株的迅速蔓延和万古霉素抗性金黄色葡萄球菌菌株的出现，使得疫苗的研制变得更为迫切。 

金黄色葡萄球菌的疫苗研制的最大障碍是金黄色葡萄球菌的毒力因子很多，包括多种毒素、多种粘附分子和荚膜等。金黄色葡萄球菌的SasA蛋白表达在金黄色葡萄球菌细胞壁上，全长由1759个氨基酸组成，分子量约为193kDa。目前有关该蛋白的功能报导还非常少。 

由于金黄色葡萄球菌毒力相关蛋白很多，毒力蛋白在临床分离的菌株中的分布也不一致，目前还没有有效的针对金黄色葡萄球菌的蛋白疫苗。目前进入临床的针对金黄色葡萄球菌的疫苗是将金黄色葡萄球菌的荚膜多糖CP5和CP8与铜绿假单胞菌的外毒素A偶联制成的，在血液透析病人进行的三期临床结果显示该疫苗存在一定的有效性。但该疫苗存在的主要问题是需要对荚膜多糖进行提取，制备过程复杂。选择金黄色葡萄球菌的保护性抗原开发基因工程蛋白疫苗是金黄色葡萄球菌疫苗研究的方向。 

在对金黄色葡萄球菌的多个毒力蛋白的免疫保护效果进行分析后，截短SasA被发现是保护效果最好的蛋白。本研究拟在大肠杆菌中的可溶性高表达制备具有天然构象的亚单位疫苗，并对该疫苗的免疫剂量、免疫效价、保护效果等方面进行研究并进一步探索截短的SasA作为亚单位疫苗可行性，为下一步深入制备金黄色葡萄球菌亚单位疫苗奠定基础。 

发明内容：

本发明的目的是提供一个经优化后可以在大肠杆菌中进行高效可溶性表达且能够激发机体对金黄色葡萄球菌感染产生免疫保护作用的金黄色葡萄球菌截短SasA基因及其编码蛋白在金黄色葡萄球菌亚单位疫苗中的应用。 

本发明所提供的金黄色葡萄球菌截短SasA基因，名称为tSasA，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID No.2的DNA序列； 

3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对金黄色葡萄球菌感染产生免疫保护作用的核苷酸序列； 

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

序列表中的SEQ ID No.1由882个碱基组成，其编码序列为自5’端第882碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。 

所述金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码的蛋白tSasA，是下述氨基酸残基序列之一： 

1)序列表中的SEQ ID No.2； 

2)将序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体对金黄色葡萄球菌感染产生免疫保护作用的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO.2由294个氨基酸残基组成。 

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以使非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。 

含有本发明基因金黄色葡萄球菌截短SasA基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。 

以pET21a(+)为载体，构建的含有金黄色葡萄球菌截短SasA基因tSasA的重组原核表达载体为pET21a-tSasA。 

本发明还提供了一种表达金黄色葡萄球菌截短SasA基因编码蛋白tSasA的方法。