[发明专利]一种鲨鱼血管生成抑制因子及其生产纯化方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种鲨鱼血管生成抑制因子及其生成纯化方法和应用。

背景技术

鲨鱼是极少患恶性肿瘤的海洋动物之一，其发病率为百万分之一。美国科学家Luer将高剂量的强致癌剂黄曲霉素B1注射到鲨鱼体内，也不能诱发鲨鱼患癌症。给鲨鱼接种癌细胞也不能诱发癌症。这提示鲨鱼体内具有独特的抗肿瘤机制(贺丽虹1，黄建华2，沈颂东等，海洋科学/2005年/第29卷/第11期：63-66)。

多年来，世界各国的研究人员多数是对鲨鱼软骨组织进行了研究，从中分离提取了多种具有肿瘤抑制作用，尤其是抑制肿瘤新生血管生长的多种物质，如Lee等(Lee A，Langer R.Shark cartilage contains inhibitors of tumorangiogenesis)首次从一条姥鲨的鳍和脊椎软骨中分离提取了一种强烈抑制实体瘤新生血管生成的活性蛋白质。

这类从鲨鱼软骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白质称之为鲨鱼血管生成抑制因子(Shark Cartilage Angiogenesis Inhibiting Factor，SCAIF)。Sheu等(Sheu JR，FuCC，Tsai ML，et al.Effect of U-995，a patent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor，on anti-angiogenesis and antitumor activities[J].Anticancer Res，1998，18(6A)：4435)。从蓝鲨软骨中分离纯化了由两条多肽组成的新血管生成抑制因子U-995，可显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖与迁移，并会引起新血管的中断和破裂，阻止破坏由肿瘤坏死因子TNF-α诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，防止由胶原酶诱导的胶原溶解。

目前，从各种鲨鱼软骨中分离提取的物质纯度不等，相对分子量大小不一，理化性质和生物学活性不尽相同的蛋白质和多糖类物质。更有人直接将鲨鱼软骨粉作为口服药物，如1997年，加拿大批准鲨鱼软骨口服液AE2941/Neovastat进入III期临床试验，它是至今进入III期临床试验为数不多的抗血管生成药物之一。

目前鲨鱼血管抑制因子(SAIF)的相关专利主要集中在提取的鲨鱼血管生成抑制因子和鲨鱼软骨粗制剂的制备和应用。由于鲨鱼的天然资源日渐枯竭，而鲨鱼人工养殖技术难题至今未能突破，造成了SAIF无法大规模应用于临床的困境，因此通过基因工程的手段克隆获得血管生成抑制因子无疑成为大规模生产SAIF的唯一途径，这对于我国海洋药物产业的可持续发展与海洋生物资源保护也将产生积极的影响。

发明内容

本发明的目的在于根据现有鲨鱼血管抑制因子的研究中存在的来源少、无法大规模应用于临床的问题，通过基因工程的手段得到一种鲨鱼血管生成抑制因子的氨基酸序列。

本发明另一目的在于提供鲨鱼血管生成抑制因子的cDNA序列。

本发明另一目的在于提供一种包含鲨鱼血管生成抑制因子的cDNA序列的重组表达载体。

本发明另一目的在于提供一种表达鲨鱼血管生成抑制因子的重组微生物。

本发明另一目的在于提供上述鲨鱼血管生成抑制因子的生产纯化方法。

本发明还有一个目的在于提供上述鲨鱼血管生成抑制因子的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明通过PCR克隆技术从条纹斑竹鲨软骨中获得鲨鱼血管生成抑制因子(SCAIF)的全长cDNA序列，该序列长692bp，序列如SEQ ID NO：2所示，其中包括552bp的开放阅读框(从第15个碱基～第563个碱基，包括一个终止密码子)，编码183个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明将上述鲨鱼血管生成抑制因子的基因序列与表达载体相连接，构建包含鲨鱼血管生产抑制因子cDNA的重组表达载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得能够表达鲨鱼血管生成抑制因子的重组蛋白。

本发明鲨鱼血管生成抑制因子的生产方法具体包括如下步骤：

(1)从鲨鱼软骨组织中提取总RNA；

(2)根据现有已知的鲨鱼血管生成抑制因子序列的保守区域设计引物，序列如SEQ ID NO：4～9所示；

(3)通过PCR扩增得到鲨鱼血管生成抑制因子的基因全长序列；

(4)将所得基因序列克隆至表达载体中，得到重组表达载体；