[发明专利]一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种高产环磷酸腺苷节杆菌及其应用。

背景技术

环磷酸腺苷是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，作为细胞内的第二信使，它对糖、脂肪、核酸、蛋白质等的代谢以及合成调节起着重要的作用。临床上用于治疗心绞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状也有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓解；此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而更有效地发挥生理及药理作用。环磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。

环磷酸腺苷的生产方法有化学合成法、酶法和发酵法三种。国内外产业化生产全部采用化学合成法，以一磷酸腺苷为原料，采用高效分离柱进行中间体分离，该方法溶剂损耗量大，收率低，成本高，产量小，且环境污染严重。利用酶法可以高效地催化三磷酸腺苷生成环磷酸腺苷，但是此方法仅仅局限于实验室阶段，离产业化还有一定的距离。

目前，国内还没有发酵法制备环磷酸腺苷的报道。在国外，1963年马克曼等在大肠杆菌Crookes株细胞中最早检出了1.1纳克/毫升的环磷酸腺苷。1971年，石山等分离筛选了某种小杆菌No.205 ATCC21376以及数株属于榜状杆菌科的细菌，通过化学诱变成抗药性突变株后，可从葡萄糖直接发酵生成2g/L以上的环磷酸腺苷。1973年，铃木报道，利用烃同化菌玫瑰色石蜡节杆菌ATCC15584菌株，能以正十四烷为碳源，发酵积累1.4g/L环磷酸腺苷。

离子注入技术作为一种生物品种改良的新技术已在诱变育种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物诱变育种的研究中，离子注入已广泛用于对微生物菌种的诱变育种，并取得了良好效果。离子注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换效应，是一种将物理诱变和化学诱变特性集于一身的综合诱变方法，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，强烈地影响生物细胞的生理、生化性能，造成遗传物质的基本单位-碱基的改变，诱发染色体结构变异(余增亮，物理，1997，26(6)：333-338)。赵洪英(天津理工学院学报，2001，17(1)：14-17)等用N⁺离子注入庆大霉素产生菌的成熟孢子，经筛选得到的菌株产抗生素能力提高27.39％。王纪(微生物学杂志，1998，18(4)：25-28)等通过离子注入诱变筛选得到一株遗传性能稳定的高产菌，得率较出发菌提高55％～60％。姚建铭(生物工程学报，2000(16)：478-481)等应用离子注入诱变筛选得到高产花生四烯酸的一株菌株，并应用于大规模生产，其产量比国外专利报道高1倍。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是提供一株环磷酸腺苷的高产发酵。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌，该节杆菌的保藏编号为CGMCC No.3584。

这种作为生产菌株的高产环磷酸腺苷的节杆菌的分类命名为节杆菌(Arthrobacter sp.)A302，目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3584，保藏日期为2010年1月18日。该菌株是通过对土壤筛选到的节杆菌进行低能离子束注入，然后将诱变后的菌株转接于平板培养基中培养，挑选单菌落转接于牛肉膏斜面培养，后经含碳源、氮源、无机盐和水的液体种子培养基和发酵培养基培养从而筛选出的环磷酸腺苷高产菌。

CGMCC No.3584菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

在固体培养基上菌落呈圆形，湿润，低凸起，表面光滑，直径为约1.5-2mm；有光泽，菌落呈黄色，幼龄菌为浅黄色，随着菌龄增加，菌落呈深黄色

2、生理与生化特性：

菌株为专性好氧菌，厌氧条件不生长；氧化酶反应为阴性，接触酶反应为阳性，硝酸盐还原反应为阳性；该菌的最佳生长温度为30℃，最适pH值为7.0，可在pH 10.0下生长；最适的NaCl浓度为1％(质量比)，在NaCl浓度为5％(质量比)时也能生长；有耐热性(55℃，加热20分钟)。

3、16S rDNA序列分析：