[发明专利]一种精子顶体反应试剂盒及诱发顶体反应检测的方法和顶体反应状况评估的方法

说明书

技术领域

本发明涉及精子顶体功能筛查，特别是在体外摸拟人体内受精的环境，在体外启动精子获能、诱发顶体反应，通过荧光染色来评价获能精子发生顶体反应的能力，从而评估精子穿透卵母细胞并使之受精的能力，为不育症病因分析、辅助生殖治疗方案的选择提供理论依据。

技术背景

男性及其相关因素至少占不孕不育夫妇病因的50％。临床实践中主要靠检测精子密度、活力和形态等指标的精液常规分析，来评价男性生育能力，但常规精液分析提供的指标只反映了精子的质量，而只有精子的功能才能反映精子体内外的授精能力(生育能力)，因此仅依靠精液常规来解释男性不育的原因和判断男性生育能力是远远不够的。然而临床实践中，全面评价精子功能是极其困难的。

近几十年来，围绕精卵相遇、结合、授精及胚胎生长发育等一系列生理过程，研究人员和临床工作者探索了多种能反映这些生理过程的精子功能试验，其中最重要的是精子顶体功能试验。顶体是精子特有的细胞结构，参与包括精卵识别、结合、穿透等受精过程的最关键步骤，对精子授精能力起决定作用。顶体反应发生在精子与卵母细胞透明带结合之后、精子穿透卵母细胞膜并使卵母细胞受精之前，是卵母细胞自然受精的必要环节之一。如无顶体的圆头精子症，精子完全不能与卵子结合，该类患者即使应用体外授精-胚胎移植技术(IVF-ET)治疗也不能授精。

目前精子顶体功能试验包括精子形态和完整性测定试验、透明带诱发精子顶体反应测定试验等，尽管这些试验对评估精子受精能力、选择和预测IVF(体外授精)或ICSI(单精子卵泡浆内注射)的成功率有积极作用，但因这些检测方法多处于研究阶段，世界卫生组织推荐的方法学太过繁琐和复杂，方法学的稳定性和重复性较差，难以在临床上作为常规方法得以普及，缺乏产业化的产品。现有的实验方法，要求整个试验过程一气呵成，从精液标本的预处理、体外获能、钙离子诱发到涂片荧光染色和结果判读，整个试验费时6～7小时，实验强度大，难以临床应用及普及。且现有试验方法的荧光染色系统强度不高，通常会在半小时内迅速衰减，影响了结果判读的准确性，会造成检测结果的不稳定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种可将精子诱发顶体反应检测实验分为两部分进行以降低实验强度、同时使试验结果更加准确、重复性好的试剂盒，同时提供利用这种试剂盒进行精子诱发顶体反应检测的方法，并提供利用这种试剂盒进行精子顶体反应状况评估的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种精子顶体反应试剂盒，其特征在于，包括组织片保存液、荧光结合物、荧光封固液。

所述组织片保存液每100ml含有：戊二醛0.5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、聚乙烯吡咯酮PVP0.2g、福尔马林1ml，余量为纯净水。

所述荧光结合物由荧光结合物PSA-FITC与荧光结合物保存液组成，pH7.5～8.0，每100ml荧光结合物保存液中加入1mg荧光结合物PSA-FITC；

其中所述荧光结合物保存液以纯净水溶解如下物质配制而成，每100ml含有：

荧光素标记物：0.5～10ng，其中，荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲基巨异硫氰酸若丹明；被标记物为豌豆凝集素、花生凝集素或刀豆蛋白A；

摩尔比为1∶2的甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物：0.4～2.4g；

Tris缓冲液：0.7～3.5g；

NaCl：0.3～1.5g；

酪蛋白：0.1～0.5g；

水杨酸钠：0.2～2.0mg；

防腐剂Proclin300：20～100ul；

余量为纯净水。

所述荧光封固液以纯净水溶解如下物质配制而成，pH8.5-9.0，每100ml含有：

N-(1，3-二甲基丁基)-N′-苯基对苯二胺：0.05～0.5g；

聚乙烯醇PVA：0.2～1.6g；

聚乙二醇8000：0.1～1.5g；

Tris缓冲液：1.0～5.0g；

NaCl：0.4～1.6g；

小牛血清白蛋白BSA：0.5～5g；

NaN₃或硫柳汞：0.01～0.05g；

甘油：6％～60％；

余量为纯净水。

所述精子顶体反应试剂盒还包括钙离子载体。

所述钙离子载体为钙离子载体A23187。

所述精子顶体反应试剂盒还包括80％密度梯度溶液、40％密度梯度溶液、精子洗涤液A、精子培养液、5×精子洗液B、对照液、固定液、组织载片、长形盖玻片。