[发明专利]一种霍乱弧菌O139群检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种霍乱弧菌O139群检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

霍乱是一类以腹泻为主要症状的烈性传染病，至今已发生7次世界大流行，1961年开始由埃尔托霍乱弧菌引起的霍乱第7次世界大流行，波及140个国家和地区，报告病例400万以上。据WHO专家会议估计，全球每年约发生550万例，其中以亚洲、非洲和拉丁美洲较为严重，引起亚洲10万和非洲2万人死亡。时至今日，霍乱仍然是最危险的烈性传染病之一。因此，早期迅速和正确的诊断对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。

目前霍乱弧菌已被分为 200 多个血清群, 但只有O1血清群和 O139 血清群能够引起流行，准确、快速地检测霍乱弧菌O139群具有十分重要的意义

传统霍乱弧菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应（PCR）技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增（Isothermal Amplification）核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术（LAMP）具有很多的优越性。

因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的霍乱弧菌O139群检测试剂盒及检测方法以解决上述问题。

基于环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplication of DNA, 简称LAMP）是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物（即内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温（63～65℃）条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP 法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需 10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术中耗时长，漏检率高的不足提供检测效果更全面、特异性高、漏检率低的霍乱弧菌O139群检测试剂盒。

霍乱弧菌O139群有多个重要抗原。本发明检测的是wbfR基因，该wbfR基因为霍乱弧菌O139群O抗原139型的编码基因，可以特异地检测出霍乱弧菌O139群。与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除霍乱弧菌O139群外，无其它菌带有该基因。

本发明所提供的霍乱弧菌O139群检测试剂盒包括下列组成：以霍乱弧菌wbfR基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物：内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3，BstDNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照。

所述的两对内外引物分别为