[发明专利]一种多年生黑麦草的遗传转化方法

权利要求书

1.一种多年生黑麦草的遗传转化方法，包括愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织切碎、根癌农杆菌的培养、根癌农杆菌侵染愈伤组织、根癌农杆菌与愈伤组织共培养、恢复除菌培养、选择培养、分化再生培养、植株继代选择培养步骤，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；根癌农杆菌浸染愈伤组织时的培养基、根癌农杆菌与愈伤组织共培养的培养基以及浸染后的恢复培养基中均添加硫辛酸；根癌农杆菌浸染愈伤组织过程，是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀；根癌农杆菌是携含目的基因、选择抗性基因和报告基因的植物表达载体质粒。

2.根据权利要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：

愈伤组织与农杆菌共培养的培养基成分为：MS基本培养基+麦芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg/L+结冷胶2.4g/L+维生素C 100mg/L+乙酰丁香酮200μmol/L+硫辛酸20-150mg/L；pH 5.2；

恢复培养基为：MS基本培养基+麦芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-D 3mg/L+结冷胶2.4g/L+维生素C 100mg/L+乙酰丁香酮200μmol/L+硫辛酸20-150mg/L+抗生素特美汀(Timentin)200mg/L；pH 5.8；

维生素C、乙酰丁香酮、硫辛酸和特美汀的添加时间为：培养基在15磅、15分钟蒸汽高压灭菌后，冷却至45-55℃时添加。

3.根据权力要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：培养基中添加20-150mg/L硫辛酸。

4.根据权力要求3所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：培养基中添加硫辛酸的浓度为50-100mg/L。

5.根据权力要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：共培养前，将愈伤组织切成直径1-3mm的组织块。

6.根据权力要求5所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：在添加了硫辛酸、不加凝固剂的液体共培养基中进行切碎愈伤组织。

7.根据权力要求1所述的多年生黑麦草遗传转化方法，其特征在于：根癌农杆菌浸染愈伤组织过程，是在愈伤组织切碎后立即加入菌液混合均匀。