[发明专利]粉纹夜蛾细胞系的克隆株及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫细胞系的克隆株，尤其涉及粉纹夜蛾细胞系的一个新克隆株，本发明还涉及该克隆株在制备杀虫病毒或重组蛋白中的用途，属于昆虫细胞生物学和生物技术领域。

背景技术

自1962年Grace建立了第一个昆虫细胞系以来(Grace T.D.C.1962，Nature，195：788-789)，利用Grace的昆虫细胞培养基或改良的Grace培养基已在100余种昆虫中建立了600余株昆虫细胞系(Chih-YuWu，2006，J.Invert.Pathol.，93：186-191)。昆虫细胞系最初用于昆虫病毒的研究，随着研究的不断开展，昆虫细胞应用范围不断扩大，特别是杆状病毒--昆虫细胞表达载体系统(Thebaculoviruses--insect cell expression system)的发明，使其成为广泛应用于真核蛋白表达最有效的手段之一(Summers，M.D.等，1987，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin，1555；O’reilly，D.R.等，1992，Baculoviruses Expression Vector：A Laboratory Manual，W.H.Freeman and company，New York，NY，USA)，该系统的优点是：杆状病毒载体能诱导大量重组蛋白产生，而昆虫细胞又有加工蛋白的能力，同时昆虫杆状病毒对哺乳动物安全。但是由于这些蛋白生产是在病毒侵染后在寄生细胞内持续进行，所以寄主细胞的生理特性(悬浮或贴壁性状，分泌能力和翻译水平等)可直接影响蛋白表达或病毒产量。

目前人们已利用几种昆虫细胞系成功的表达和生产多种病毒和重组蛋白(前列腺癌，淋巴癌，宫颈癌，肝炎等疾病的疫苗)(Granados，R.R等，1994，J.Invert.Pathol.，64：260-266；Altman，F.等1999，Glycoconj，J.，16：109-123；Jarvis，D.L.，1997，in L.Miller等，The Baculoviruses：389-431，Plenum Press.NY，USA)。虽然目前已建立600余株细胞系，但由于其特性不同，包括生长特性，对病毒的受纳性，重组蛋白表达等，适合上述应用条件的细胞株还很少。目前仅限于草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf-21及其克隆株Sf-9和粉纹夜蛾细胞株BTI-Tn5B1-4(商品名称High Five即Hi 5)(Gardiner，G.R.，1975，J.Invert.Pathol.，25：363-369；1970，J Invert.Pathol.，16：284-228；Vaughn，J.h.等，1977，In Vitro.13：213-217)。Tn5B1-4细胞是从Tn5B1中克隆出的新细胞系(Granados，R.R.，等1986 Virology，152：472-476；1994，J.Invert.Pathol.，64：260-266)，Tn5B1-4细胞与Sf-21和Sf-9细胞比较，它具有对AcMNPV病毒更敏感，产量高，对多种重组蛋白有高表达水平。最近又通过对Tn5B1-4细胞的进一步克隆，获得两个新细胞克隆株H5CL-B和H5CL-F(Li Guoxun等，2003，Bioprocessing，2(1)：58-62)，它们比野生型细胞Tn5B1-4有更优良的特性，其重组蛋白表达可提高1-2倍。从中可以看出，对已建立的细胞系进行再克隆和筛选，仍然可以获得更优良的新克隆株。

虽然上述细胞系目前被广泛应用，但还存在某些缺点而影响产量和表达，因此，需要不断改善。首先Sf-21和Sf-9细胞系无论在病毒产量(OB)和重组蛋白表达都远不如Tn5B1-4细胞，而Tn5B1-4细胞虽然有较高的病毒产量和重组蛋白表达水平，但由于培养过程中有很强的贴壁特性而大量结块，不适于悬浮大量培养，而影响病毒产量和重组蛋白表达。本发明人新建立了一株悬浮培养细胞系QB-TN9-4S(Ming Mengjuan等，2008，Inseet Science，15：423-428)，该悬浮培养细胞系虽然有更好的性状，但该细胞系来自于胚胎，细胞组分复杂，个体间的特性差异很大，使这一混合细胞群体不能发挥某些个体的更优良特性。为此，对这一细胞系进行克隆和筛选。

发明内容