[发明专利]启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一个启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体。

背景技术

以大肠杆菌作为宿主菌来表达目的基因而大量获得目的蛋白是现代生物技术的重要组成部分。所得到的蛋白可以用来进行功能研究、作为催化合成具有重要价值的产物的酶，也可以作为蛋白质药物而直接用于疾病的治疗。

依据蛋白质三维结构的正确折叠与否，所表达的蛋白可分为正确折叠的可溶性蛋白组份以及错误折叠的不可溶性蛋白(包涵体)组份，它们分别位于经超声波破碎再离心后的上清和沉淀中。可溶性蛋白组份由于正确折叠而保持生物学活性，是人们所需要的蛋白形式。而包涵体是细胞内凝集、无活性的固体蛋白颗粒。为使包涵体形式的蛋白呈现水溶性和生物学活性，需要进行变性和复性的处理。变性是指将包涵体组份经过变性剂如6M的盐酸胍或者8M尿素的处理，复性是指将变性蛋白通过加入共溶剂如PEG 6,000～20,000、去污剂及表面活性剂如Trition X-100或氧化-还原剂如还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽等形式的处理使之形成正确折叠的三维结构。这种变性和复性的过程不仅耗时，烦琐，而且造成蛋白产量的损失，更重要的是蛋白的活性会急剧减少甚至完全丧失。

鉴于蛋白可溶性性质的重要性，增加目的蛋白表达为可溶性蛋白组份的比例成为分子生物学和生物化学研究中的重要工作。改变诱导表达的条件如温度、诱导剂(常见的是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，英文缩写：IPTG)等等常常不能奏效。加入融合标签和伴侣蛋白是两种有效的方式，前者是指将目的蛋白与融合标签融合为融合蛋白，常用的融合标签有6xHis(6个组氨酸)，MBP(麦芽糖结合蛋白)，NusA(氮源利用物质A)等。由于融合标签有着很好的表达可溶性蛋白组份的性质，将目的基因与之融合后，可促进目的蛋白表达成为可溶性组份。第二种方法是指利用伴侣蛋白来促进目的蛋白的正确折叠。伴侣蛋白的主要类型有GroES-EL，DnaK及启动因子(trigger factor)等。大肠杆菌(Escherichia coli)的启动因子为48.2KD的蛋白，研究证明启动因子能有效地促进靶蛋白正确折叠而增加其可溶性，其作用机理是：1.在新生肽链的合成和起始折叠过程中以其长的疏水区域保护新生肽链，2.加速肽脯氨酰顺反异构化。

通常是将伴侣蛋白基因和目的蛋白基因克隆在不同的质粒上，二个质粒在细胞内共存，并经不同的诱导剂诱导所克隆的基因表达。已报道的将启动因子作为伴侣蛋白来增加目的蛋白可溶性的为日本Takara公司的双质粒系统，其中一个质粒表达启动因子，如pTf16经L-阿拉伯糖诱导后表达启动因子，pG-Tf2经热失活的氯四环素诱导后表达启动因子和GroES-GroEL，另外一个质粒经IPTG受诱导后表达目的蛋白，目的蛋白经启动因子的作用而增加可溶性。两个质粒的因抗性不同和复制子不同而可以共存于一个细胞中(文献：Nishihara K，Kanemori M，Yanagi H et al.Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinantproteins in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 2000；66(3)：884-9)。这种双质粒系统的缺点在于：1.需要将两个质粒分别转化至蛋白表达的宿主菌，这样增加了操作步骤。2.由于目的基因和伴侣蛋白基因是在不同的质粒上，并且由不同的诱导剂进行诱导表达，因此伴侣蛋白和目的蛋白的摩尔数难以保持一致，导致伴侣蛋白对目的蛋白的作用难以完全。3.如果伴侣蛋白和目的蛋白大小相近，则难以分辨，也导致对目的蛋白的纯化困难。

发明内容