[发明专利]一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖的制备方法

权利要求书

1.一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖，其特征在于外观为白色粉末，是茶树菇通过深层发酵获得的湿菌丝体经过匀浆，热水浸提，离心，上清液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，透析后冷冻干燥得到的。无毒，具有显著的免疫增强活性；茶树菇发酵菌丝体含有17种氨基酸，其总量为16.441g/100g菌丝体干重，必需氨基酸总量为6.787g/100g菌丝体干重，占氨基酸总量的41.28％，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高；茶树菇菌丝体含有较高的Ca、Fe、Zn等人体易缺少的微量元素，有害重金属元素的含量较少；该多糖所含单糖以葡萄糖为主，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为63.4％。

2.权利要求1所述的茶树菇胞外多糖的制备方法。该方法由下列步骤组成：

(1)菌种培养

出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；

①组织分离法

斜面培养基：PDA培养基，含1.5％～2.0％琼脂，pH自然；

组织分离方法：将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，pH自然，置于25℃温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；

②摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，pH6.0；

培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于25℃，150r/min，振荡培养7d；

③摇瓶发酵培养

发酵培养基：玉米粉2g/100mL、酵母粉0.3g/100mL、磷酸二氢钾0.2g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL；

培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中25℃，150r/min，振荡培养7d；

(2)胞内粗多糖的提取

湿菌丝体匀浆，热水80℃-90℃浸提，加水量为4倍体积湿菌丝体，总提取时间为10h，提取3次，提取液浓缩后加入3倍体积95％乙醇在4℃醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后Sevage法去除游离蛋白，H₂O₂脱色、蒸馏水透析，冷冻干燥后得到茶树菇胞内粗多糖。

3.如权利要求2所述的茶树菇胞内多糖的制备方法，其特征在于所述的Sevage法去除游离蛋白是按多糖溶液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20mi；蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。

4.如权利要求2所述的茶树菇胞内多糖的制备方法，其特征在于所述的H₂O₂脱色是将5％的多糖溶液用NaOH调pH至9.0，然后滴加20％的H₂O₂(用量为多糖溶液体积的15％)，保持PH8.0-9.0，4h后终止反应，加入95％乙醇置4℃冰箱过夜，次日离心收集沉淀。

5.如权利要求2所述的茶树菇胞内多糖的制备方法，其特征在于所述的透析是指4℃醇析过夜后的离心沉淀物用蒸馏水复溶后取50mL装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次。

6.权利要求1所述的胞内多糖具有免疫增强功能。