[发明专利]一种智能电泳控温槽及时间温度-凝胶梯度电泳系统

说明书

技术领域

本发明涉及核酸电泳领域，具体涉及一种时间温度-凝胶梯度电泳（TTGG，Temporaltemperaturegelgradientelectrophoresis）控温槽及包含该控温槽的电泳系统。

背景技术

综合已有文献，DGGE（Denaturedgradientgelelectrophoresis，变性梯度凝胶电泳）、TGGE（Temperaturegradientgelelectrophoresis，温度梯度凝胶电泳）、TTGE（Temporaltemperaturegradientgelelectrophoresis，时间温度梯度凝胶电泳）等电泳技术均可用来检测DNA点突变和基因多样性。其中，DGGE电泳系统出现最早，应用也较广。变性梯度凝胶电泳（DGGE）是由Fischer等（1979）最先提出并用于检测DNA突变的一种电泳技术。Muyzer等（1993）首次将DGGE用于微生物生态学研究，完整精确地描述了微生物群落结构、相对比例和系统进化关系。

DGGE原理是：一定浓度的化学变性剂（通常为甲酰胺、尿素等）会使DNA双螺旋解链，GC含量是影响解链温度的主要因素。解链温度较低的区域称作低温解链区（lowermeltingdomain）。如果在某一变性剂浓度位置低温解链区已经解链，那么双螺旋就由未解链部分连在一起，未解链区域称作高温解链区（highmeltingdomain）。某一基因型双链在较低变性剂浓度位置首先解链（通常为突变株或解链温度较低的双链），而另一基因型双链则在较高变性剂浓度位置解链（通常为野生株或解链温度较高的双链），开始解链的DNA片段泳动速度急剧下降，梯度变性凝胶可将二者分开。通常环境样品的PCR产物中含有野生双链、突变双链以及异源双链等片段（异源双链常常是在PCR扩增时错配产生，异源双链通常可以远远地与同源双链分开）。为使仅有一个碱基之差的不同DNA双链较好地分离，需要选择合适的变性剂浓度梯度范围，并且在PCR前向引物的5’端加40-50bp的GC夹（GCclamp），人工形成一个高温解链区（Sheffieldetal.,1989）。这样，片段的其他部分就处在低温解链区，有利于提高分离效果。目前，DGGE电泳在恒定温度下进行（电泳时间达16小时），凝胶中不同浓度的变性剂在长时间电泳过程中容易扩散，影响浓度梯度的均匀分布，使样品在非线性梯度范围内泳动，难以分离解链温度较近的片段，影响电泳实验的分辨率和可重复性（Kisand&Wikner,2003）。

TGGE的原理是：引入空间温度梯度代替变性剂梯度。在远离加样孔的方向，温度逐步升高，双链DNA在泳动过程中开始解链，不同GC含量双链的解链位置有差异，影响了泳动速度，从而达到分离效果（Riesneretal.,1990）。目前，TGGE系统采用半导体模块实现空间温度梯度，售价相当昂贵；同时TGGE对实验者和实验环境的要求较高，限制了TGGE的推广。因此，国内外采用TGGE的研究论文远远少于DGGE。

TTGE的原理是：用时间温度梯度取代空间温度梯度，随着时间推移电泳装置均匀升温，使双链DNA逐步解链实现分离（Yoshinoetal.,1991）。TTGE电泳时间比DGGE大幅缩短，但是分辨率有待于提高（Marieetal.,2006）。

综上所述，为使DNA的解链温度在合适范围（通常为50-70℃），TGGE和TTGE使用恒定浓度的变性剂来降低双链DNA的解链温度，并且DGGE、TGGE、TTGE均使用恒定单体浓度的聚丙烯酰胺凝胶（即凝胶孔径一致），这影响了凝胶的分离效果，降低了分辨率（Cremonesietal.,1997;Petri&Imhoff,2001）。

本发明采用独创的时间温度-凝胶梯度（TTGG）电泳系统，将恒定变性剂浓度的孔径梯度凝胶与智能控温槽相结合，电泳过程中控温槽逐步升温，实现DNA片段的分离（表1）。TTGG比DGGE节约一半以上的电泳时间，消除DGGE的变性剂梯度扩散而影响重复性，避免使用昂贵的TGGE半导体模块，在引物设计过程中可以省去GC夹（Chenetal.1999）。TTGG引入凝胶孔径梯度的分子筛效应，在节约时间和金钱的同时提高了分辨率和结果的可重复性（图2）。

 

对于TTGG而言，电泳温度参数（升温范围和升温速度）与凝胶孔径梯度的选择尤为重要。

1解链温度（Tm值）的计算

长度为25bp以下的双链DNA序列Tm(℃)=4*(G+C)+2*(A+T)