[发明专利]提高转基因生物耐盐性的基因LcGST及其制备以及利用其编码的蛋白

权利要求书

1.提高转基因生物耐盐性的基因LcGST，其特征在于其序列如下：ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCAT GAGAGTCAGAATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTT GAGGAACAAGAGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCT CATCCACAATGGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGT GTGGAATGATGCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATT CTGGGCTGATTATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAA AAATGAAGAAAGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGA ACAGCTCGGAGACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACT TGTTCCATTCTACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG TGAGTGCCCCAAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCATGACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。

2.根据权利要求1所述的可提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：

(1)首先以已知的大豆谷胱甘肽S-转移酶基因的编码序列在美国国立生物技术信息中心百脉根的表达序列标签数据库中为LcGST基因寻找证据，获得同源性很高3条EST序列，序列号分别为BW597792.1、BW599863.1和BW594579.1，利用DNAMAN软件对检索获得的EST序列进行电子拼接，获得了相应的含有完整开放阅读框的拼接序列；

(2)依拼接序列设计特异性引物，LcGST基因的外侧上游引物为5’-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3’，外侧下游引物为5’-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3’；内侧上游引物为5’-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3’，内侧下游引物为5’-CTGGGATCCCTCGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3’，将内侧上、下游引物分别引入Kpn I和BamH I酶切位点；

(3)利用设计的特异性引物以百脉根培养21天后的叶片组织cDNA为模板进行巢式PCR扩增，获得目的条带；

(4)PCR终产物回收后与pMD1-T连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行测序，测序与预期结果一致。

3.根据权利要求2所述的可提高转基因生物耐盐性的基因LcGST的制备，其特征在于所述的步骤(3)是利用设计的特异性引物，以百脉根培养21天后叶片组织的cDNA为模板在扩增仪上按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的程序进行PCR扩增；以此PCR产物稀释100倍后取1μl作模板进行PCR扩增，按照94℃预变性5分钟；30个PCR循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的条件进行，两次PCR反应均按如下成份及用量进行：

ddH₂0                            10.5μl

10x PCR Buffer                   2μl

dNTP(2.5mmo l/L)                 2μl

10umol/L的上游引物               2μl

10umol/L下游引物                 2μl

模板                             1μl

Taq plus DNA polymerase(5U/μl)  0.5μl