[发明专利]检测耐药结核分支杆菌(MDR-TB)的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测耐药结核分枝杆菌的方法，包括：

在一个扩增反应中扩增基因组区域，其中，所述基因组区域中的突变引起了结核分枝杆菌的耐药；

所述扩增反应的扩增体系包括至少一条标记的寡核苷酸探针，至少一对扩增引物和一个热稳定的DNA聚合酶；

标记的寡核苷酸探针与扩增的基因组区域杂交形成的熔解曲线分析中产生一个熔解谱；

所述标记的寡核苷酸探针与靶核苷酸序列杂交区域至少要包含一个突变核苷酸、或包含两个甚至更多的突变核苷酸，且所述标记的寡核苷酸探针与野生型或突变型靶核苷酸序列的突变位点互补；

所述寡核苷酸探针是双标记探针，包括一个报告标记和一个猝灭标记；

所述猝灭标记是非荧光猝灭基团，它标记在寡核苷酸探针的3’末端；所述报告标记是荧光基团，它可以标记在寡核苷酸探针内部的核苷酸残基上或5’末端；

当双标记寡核苷酸探针处于未与扩增的基因组区域杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；当双标记寡核苷酸探针与扩增的基因组区域杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此双标记寡核苷酸探针未与扩增的基因组区域杂交而处于单链状态时的荧光强度；

所述扩增是不对称扩增，扩增中一条引物的浓度高于另外一条与之配对引物的浓度。

2.根据权利要求1中的方法，所述基因组区域选自以下的基因的一种或多种：其中包括与耐利福(RIF)平相关的RpoB基因，与耐异烟肼(INH)相关的KatG基因、mabA(fabG1)-inhA启动子和oxyR-ahpC基因间区域，与耐乙胺丁醇(EMB)相关的embB基因，与耐吡嗪酰胺(PZA)相关的pncA基因，与耐链霉素(STR)相关的rpsL和rrs基因，与耐左氧氟沙星相关的gyrA基因；

所述基因组区域中的突变包括，rpoB基因的511、513、515、516、518、519、522、526、531和533位点，embB基因的306位点，katG基因的315位点，inhA基因的-15和-8位点，ahpC基因-6、-9、-10和-12位点等18个突变位点。

3.根据权利要求1中的方法，在标记寡核苷酸的熔解曲线分析中，产生熔解谱的步骤还包括当探针与靶核酸序列分离时，确定扩增产物荧光强度变化负一次导数(-df/dT)最大值的步骤。

4.根据权利要求1中的方法，所述DNA聚合酶是不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。

5.根据权利要求1中的方法，所述扩增是多重检测反应，反应中至少存在两条与不同基因组区域杂交的探针；所述的至少两条探针的每条可以都与野生型序列匹配，也可以每条都与突变型序列匹配，还可以其中一条与野生型序列匹配，另外一条与突变型序列匹配；所述两条探针可以包含在单一信号检测通道内检测的相同或相似的染料标记，或者也可以包含在不同信号检测通道内检测的不同颜料标记。

6.根据权利要求1中的方法，其中一条探针包含不与扩增序列互补的核苷酸，此探针与包含9bp回文结构序列的RpoB基因的81bp核心区域杂交，上述探针中所包含的不与扩增序列互补的核苷酸阻止了探针自身发夹结构的形成。

7.根据权利要求1中的方法，所述引物选自序列表中的SEQ ID NO：1～SEQID NO：16，所述探针选自序列表中的SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：36。

8.一种检测耐药结核分枝杆菌的探针，其特征在于：此探针由25～50个核苷酸组成，在杂交的条件下，它能够与结核分枝杆菌RpoB基因81bp的核心区域杂交；上述探针包括一个标记在3’末端的猝灭标记和一个标记在内部核苷酸残基上或5’末端的报告标记；所述探针杂交在包含RpoB基因526、531和533密码子的区域，探针含有与扩增序列不互补的核苷酸；所述探针与包含9bp回文结构序列的RpoB基因的81bp核心区域杂交；上述探针中所包含的不与扩增序列互补的核苷酸阻止了探针自身发夹结构的形成。9.根据权利要求8中的探针，所述探针选自本说明书序列表中的SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31。

10.一个从样本中检测耐药结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括：至少一对扩增引物和至少一条标记的寡核苷酸探针，此寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记；当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；

当寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

其中所述猝灭标记是非荧光猝灭基团，且标记在探针的3’末端；

其中所述报告标记是荧光基团，且标记在在寡核苷酸探针的内部核苷酸残基上或标记在探针的5’末端；

还包括热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列扩增所需其它常用各组分；

其中所述引物选自序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16；

其中所述探针选自序列表中的SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：36。