[发明专利]一种聚丙烯酰胺凝胶电泳中的DNA银染方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域的电泳染色方法，具体涉及一种聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中的DNA银染方法。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳是分析蛋白质和核酸样品的一种常用的方法，在分子生物学及相关学科的基础和临床研究中得以广泛的应用。电泳后对样品的显示有许多的方法，银染法因具有灵敏度高、无毒无害且显色结果可以随干胶直接保存等优点而得以广泛应用，特别是近几年在SSCP、DDPCR和DNA测序等实验中更显示出其优越性。传统的银染方法主要包含下面几个步骤：（1）预处理与固定，（2）染色，（3）显色，（4）终止反应。整个过程比较繁琐，要用到蒸馏水或去离子水、乙醇、硝酸、硝酸银、碳酸钠、甲醛、硫代硫酸钠、乙酸等多种化学试剂。近年来，许多研究人员对PAGE胶中蛋白质和DNA的银染和显色的过程优化进行了探索，以求得到简便、快速、灵敏度高且消耗低的银染显色方法，但改良后的方法，染色与显色的整个过程仍然至少需要40～50min。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种快速、灵敏和有效的聚丙烯酰胺（PAGE）电泳中的DNA银染方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种聚丙烯酰胺（PAGE）电泳中的DNA银染方法，其特征在于，该方法先用质量浓度0.1%的AgNO₃浸泡聚丙烯酰胺凝胶10min–15min，然后对用浸泡后的聚丙烯酰胺凝胶蒸馏水清洗凝胶2次，再用质量分数0.04%的Na₂CO₃、每升含有质量浓度37%的HCOH，2mL、质量分数2%的NaOH的混合溶液显色5min–6min，显色后用蒸馏水冲洗聚丙烯酰胺凝胶2次。

所述的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为8%或12%，交联度为29：1。

本发明与现有技术相比，具有以下有益的技术效果：

传统的DNA银染方法需要5-6种化学试剂，配制4种溶液，花费40-60min才能完成染色步骤，而本方法只需要4种化学试剂，即硝酸银（AgNO₃）、氢氧化钠（NaOH）、碳酸钠（Na₂CO₃）和甲醛（HCOH），配制2种溶液，花费20min就可以达到与传统染色方法相同的结果，而且在变性聚丙烯酰胺电泳（PAGE）中，该方法可以将DNA的用量降低到0.44ng；在非变性聚丙烯酰胺电泳（PAGE）中可以将DNA的用量降低到3.5ng。本方法与传统染色方法相比，不仅节约了时间，降低了成本，而且提高了检测的灵敏度。

附图说明

图1是采用本发明对GDF9基因外显子1的PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶（浓度12%）电泳检测对比图，图中，A表示本发明的DNA银染方法；B表示采用传统方法1；C表示采用传统方法2；D表示采用传统方法3；

图2是采用本发明对微卫星BM1329PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶（浓度8%）电泳检测图，图中，1、2、3和8表示：关中奶山羊；4和5表示：济宁青山羊；6和7表示：布尔山羊；9和10表示：西农萨能奶山羊，M表示pBR322DNA/MspI；

图3是采用本发明对GDF9基因外显子2PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶（浓度12%）电泳检测图，图中，1、2和3表示：关中奶山羊；4、5和7表示：济宁青山羊；6和8表示：布尔山羊；9、10和11表示：西农萨能奶山羊；

以下通过对3种传统的DNA银染方法与本发明的DNA银染方法的实施例进行比较分析，对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

1、3种传统的DNA银染方法与本发明的DNA银染方法的比较

按照表1的操作步骤对3种传统的DNA银染方法（图中的方法1、方法2和方法3）与本发明的DNA银染方法进行比较，电泳检测结果如图1所示，从图1可知，本发明的染色方法明显优于3种传统的染色方法。

用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测400头山羊的微卫星BM1329，使用本发明的DNA银染方法染色，检测结果如图2所示；

用12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测400头山羊GDF9基因外显子2的多态性，使用本发明的DNA银染方法染色，试验结果如图3所示。

从图2和图3可知，使用优化后的DNA银染方法染色能够获得良好的试验结果。

表1：3种传统的DNA银染方法与本发明的DNA银染方法操作步骤的比较

注：表中所用试剂为质量浓度。