[发明专利]中药注射剂微量蛋白检测方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及中药注射剂杂质检测领域，用于中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。

技术背景

中药注射剂最早产生在1946年，由钱信忠等学者开创。在中国医药界，中药注射剂已经广泛应用于临床。2005年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵及双黄连等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的有效性问题，对于安全性依然是业界难题。

然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方面分析，这些不良反应主要属于过敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理性免疫反应。因此减少中药注射剂中的过敏性物质是提高中药注射剂安全性的关键策略之一。

中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的量较少，但微量的蛋白仍足以导致诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白与人的同源性差异大，因此常具有很强的抗原性。现行药典(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法沿用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37～110μg/ml左右，低于此限量的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37μg/ml的中药注射剂将被视为“合格”。而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白的结果，这导致磺基水杨酸法应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等，却因为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差，不适合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。为了提高安全性，有必要进一步控制中药注射剂中的蛋白含量，因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂蛋白质检测方法很有必要。

由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本发明是针对中药注射剂的特点而建立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。

发明内容

本发明利用某些膜能将蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白检测的灵敏性和特异性。本方法包括以下三个步骤：

1、先将中药注射剂样品点到蛋白特异性吸附膜上；

2、用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；

3、将点样膜进行考马斯亮蓝显色。

在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜(Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)。

在以上步骤2中，采用的有机溶液浓度为0-100％，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除中药注射剂本色为度。如果中药注射剂点样后几乎无色，本步骤可以跳过直接进入步骤3。

步骤3进行考马斯亮蓝显色时，考马斯亮蓝的浓度不限。可以直接染色；也可以染色后进行脱色处理，以降低膜的背景。含有一定蛋白质浓度的中药注射剂会显示出稳定的蓝色。

本方法实施的效果是，检测的灵敏性和特异性高，抗干扰能力强。

附图说明

图1为建立PVDF膜吸附染色检测蛋白方法，确定本发明检测限的染色结果图：a为点样后风干拍片的结果，b为甲醇洗涤后风干拍片的结果，c为染考马斯亮蓝并脱色后风干拍片的结果，a、b、c中的A组样品来自标准BSA溶液，用PBS溶液配制，B组为用丹参注射液配制的BSA样品，从左至右浓度依次均为9mg/ml、3mg/ml、1mg/ml、0.33mg/ml、0.1mg/ml、37μg/ml、12μg/ml、4μg/ml、1.3μg/ml、0μg/ml，点样量为1μl。