[发明专利]利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境保护和食品安全等技术领域，具体地说涉及利用ATP发光的变化进行水环境有毒有害物质急性毒性检测的方法。

背景技术

近年来，突发性环境污染事故呈增加趋势，这直接威胁了国家的生态安全和人体健康，而要解决此类问题则需要从毒性监测的角度对水环境质量进行定量的评价。

目前控制水体中毒性的方法主要是对特定的有毒化学物质进行单个指标控制，通过对控制项目检测结果的判定来推断待检样品中是否有毒性。但对水体中可能存在多种对人体有害或有潜在致病风险的化合物，在事故发生后短时间内利用化学分析确定其组分并判断是否有害是不现实的。因此急需一种快速、简便、经济的检测方法以便给决策者提供参考。在实践应用中，水的毒性效应是一项综合的生物学参数，目前已使用的对水毒性的测试的传统生物学方法包括浮游动物试验、藻类试验和鱼类试验等。但是它们都因时间长、费用高，操作繁琐，不适宜突发环境事件的预警。

近年来，一些快速、简便、经济的现代化的检测方法逐步发展起来，比如生物发光毒性检测方法、化学发光毒性检测方法等。其中生物发光毒性检测方法是应用最为广泛也是较为成熟的技术，它可分为热发光和冷发光两种方式。热发光的典型代表是发光细菌毒性检测技术，它是基于毒性物质对发光细菌发光强度的抑制作用而设计的，通过测定发光细菌发光强度的变化，评价环境样品中重金属和有机物质的急性毒性。国内外已经有了许多的研究和改进，已经从原来的发光机理研究转向发光应用的研究，在环境方面，开发出能实时连续监控的各种发光细菌生物传感器，检测的领域包括水、土壤、大气。虽然发光细菌毒性检测具有快速、灵敏、操作简单的优点，但是成套设备较昂贵，一次测试的时间最少需要15分钟。所以人们根据萤火虫发光的原理，在体外创造发光的环境开发出了冷发光的检测方法即ATP生物发光法。

ATP生物发光法在环境的应用大都是检测环境中的微生物数量方面，取代操作繁琐的平板计数法，通过裂解剂处理样品，使其释放出ATP，然后向样品中加入发光试剂虫荧光素-虫荧光素酶，根据发光强度与ATP的关系推断出样品的微生物量。应用较多的是各种水体、食品、乳制品中的微生物数量的检测，但ATP生物发光法用于环境急性毒性检测的鲜有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作方便、可用于现场测试且测试成本较低的利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用ATP生物发光进行水环境急性毒性检测的方法，向反应试管中依次先后加入ATP反应试剂、虫荧光素酶、ATP标准品、待检测水体，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为实验组；向反应试管中依次先后加入与实验组相同的检测试剂(即相同的ATP反应试剂、虫荧光素酶和ATP标准品)，以蒸馏水为无毒的参照物，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为30s，以此为对照组；实验组和对照组均重复操作检测三次；

所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：所述的ATP反应试剂包含如下浓度的组分：虫荧光素10～100mg/L、Mg²⁺5～100mmol/L、EDTA 0.5～50mmol/L、Tris-HCl缓冲液10～100mmol/L；ATP反应试剂优选包含如下浓度的组分：虫荧光素20mg/L、Mg²⁺10mmol/L、EDTA 1mmol/L、Tris-HCl缓冲液25mmol/L；

所述的ATP标准品浓度为10^-10～10^-3mol/L，优选浓度为10^-5mol/L；

按下式计算相对发光率K：

相对发光率K＝实验组三次试验发光强度之和/对照组三次试验发光强度之和；

当K＞70％，则毒性级别为低毒；

当50％＜K≤70％，则毒性级别为中毒；

当30％＜K≤50％，则毒性级别为重毒；

当0％＜K≤30％，则毒性级别为高毒；

当K＝0，则毒性级别为剧毒。

其中，所述的ATP反应试剂加入体积为10μL～4mL，优选400μL。

其中，所述的虫荧光素酶加入体积为10μL～250μL，优选25μL。

其中，所述的ATP标准品加入体积为10μL～250μL，优选25μL。

其中，所述的待检测水体加入体积为20μL～0.5mL，优选50μL。

其中，所述的ATP荧光检测仪为便携式。