[发明专利]一种Ⅳ型胶原酶含量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定人体血浆、血清中Ⅳ型胶原酶含量的测定方法。

背景技术

Ⅳ型胶原酶是生物体内重要的基质金属蛋白酶，又称基底膜性胶原酶，在细胞迁移、创伤修复、恶性肿瘤的浸润与转移等过程中发挥重要的病理生理作用。目前研究表明，血浆Ⅳ型胶原酶含量的异常增高常与心脏衰竭、肺气肿、自身免疫性疾病、肿瘤生长及肿瘤细胞的侵袭和转移等重大疾病密切相关。为了更广泛的研究Ⅳ型胶原酶的病理生理作用，建立快捷、精确、低成本、高通量的检测方法具有重要意义。

目前检测血浆Ⅳ型胶原酶活性的方法主要有3种：底物胶电泳酶谱法、ELISA和HPLC。底物胶电泳酶谱法分析时间长达数天，分析步骤复杂。ELISA法虽具有特异性、灵敏度高的优势，但所需标记抗体成本高，试剂盒昂贵，测定出的酶含量不能表现出酶的生物学活性，同时分析速度慢。HPLC虽具有分析速度快，定量准确等优点，但方法特异性差，不能进行大样本同时检测，难以满足临床检测要求。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题而提供了一种Ⅳ型胶原酶含量测定方法，利用该方法可以准确、快速的测定到人体血浆或血清中Ⅳ型胶原酶的含量。

本发明所采用的技术方案是：

一种Ⅳ型胶原酶含量测定方法，包括以下步骤：

a）分别准备空白管、标准管和待测样品管；首先向空白管、标准管和待测样品加入底物溶液，所述底物溶液为5mg/ml～10mg/ml琥珀酰明胶；接着向空白管中加入样品稀释液，向标准管中加入标准品，向待测样品管中加入待测样品，所述样品稀释液为体积百分比为40mmol/l～60mmol/lTris缓冲液、5mmol/l～15mmol/lCaCl₂、10μmol/l～20μmol/lZnCl₂以及质量百分数为0.05%～0.1%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，所述标准品为已知浓度的Ⅳ型胶原酶；最后向标准管和待测样品管中加入样品稀释液，在35^oC～45^oC水浴反应30～120分钟；

b）在空白管、标准管和待测样品管中加入终止液终止酶切反应，再加入检测溶液A和检测溶液B，最后加入检测稀释液，在35^oC～45^oC水浴下显色反应30～60分钟，使其显色反应充分进行，所述终止液为质量百分数为0.05%～0.2%HCL,检测溶液A为0.1M～0.5MNaOH，检测溶液B为质量百分数为0.01%～0.05%三硝基苯磺酸，检测稀释液为双蒸水；

c）各管冷却至室温后，取各管溶液至酶标板中，用酶标仪测定吸光度;

d）以标准物的浓度为横坐标，测定出的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，根据待测样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的待测样品的Ⅳ型胶原酶含量；或者用标准物的浓度与吸光度值算出标准曲线的方程，将待测样品的吸光度值代入方程，计算出待测样品的Ⅳ型胶原酶含量。

优选地，所述标准管的数量至少为六个。

进一步地，所述待测样品为血清或血浆。

优选地，所述酶标仪在400nm～440nm处测定吸光度。

本发明具有以下优点：

本发明利用Ⅳ型胶原酶具有水解明胶的特异性结合位点，而血浆中存在的其它基质金属蛋白酶难以水解明胶，采用TNBS对明胶的水解产物进行显色，可以对人体血浆和血清中的Ⅳ型胶原酶进行特异性的定量分析。该测定方法以琥珀酰明胶作为酶切底物，采用TNBS显色剂对酶切产生的末端氨基显色，TNBS与末端氨基结合的情况下颜色变黄，颜色的深浅和样品中的Ⅳ型胶原酶含量呈正相关。用酶标仪在特定波长下测定吸光度，计算样品浓度。本方法可以快速、准确的测定出人体血浆或血清中Ⅳ型胶原酶的含量，且测量结果直接体现出血浆当中具有活性意义的Ⅳ型胶原酶含量，无需再进一步检测抑制物的含量。

附图说明

图1为实施例1Ⅳ型胶原酶的标准曲线；

图2为健康人血浆Ⅳ型胶原酶含量分布图。

具体实施方式

实施例1：本实施例来测定一个血清样本的Ⅳ型胶原酶含量。首先对待测血样进行处理，将全血标本2500转离心5分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。需要注意的是：血清在检测前应稀释8倍再做检测，在置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃或-80℃不应超过1个月，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。