[发明专利]一种唾液蛋白样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明属电泳蛋白质样品制备技术领域，具体涉及一种有关全唾液蛋白质的制备方法。

背景技术

近年来，唾液的临床诊断价值逐渐为人们所认识。唾液通过非侵入方式获得、对机体无创伤、可用于大样本筛查、利于纵向动态观察。因此，越来越多的临床工作者将唾液蛋白质组学的策略应用于生理和病理状态下唾液蛋白质种类和功能的研究。但由于唾液中含有大量粘蛋白，会造成蛋白质组学工作中样品制备的困难和分离分析的误差，影响实验重复性。

人类的唾液粘蛋白是蛋白质和碳水化合物的共价复合物，可分为两类，即高相对分子质量粘蛋白(MG1)和低相对分子质量粘蛋白(MG2)。MG1分子量大于1000kDa，MG2分子量为200-250kDa。此类糖蛋白具有优良的组织覆盖作用，以润滑、维持口腔粘膜完整性。但由于唾液粘蛋白性质粘稠、含量丰富(约占总蛋白7％-20％)、分子量大，在唾液蛋白质组样品制备和分离分析中，会造成实验误差，影响实验重复性。例如粘蛋白粘稠的性质会使上样量产生误差；粘蛋白的大分子量会阻塞电泳凝胶孔径影响分离效果；粘蛋白作为一种高丰度蛋白，会影响蛋白样品中其它低丰度蛋白的上样量。所以在唾液蛋白质组蛋白样品制备过程中，必须给予去除。

发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种唾液蛋白样品的制备方法，主要通过稀乙酸沉淀去除粘蛋白而实现。

所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)收集唾液；2)将收集的唾液于4℃，800g离心15min，吸取上清液；3)加入体积浓度为0.05％-5％的稀乙酸，混匀；4)4℃，14000g离心60min，吸取上清液；5)将上清液放入透析袋中用双蒸水透析5h；6)浓缩，得到唾液蛋白样品。

所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸的体积浓度为0.1％-0.5％。

所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸的体积浓度为0.15％。

所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸体积为步骤2)中吸取的上清液体积的1-4倍。

所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸体积为步骤2)中吸取的上清液体积的2倍。

所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤6)所用的浓缩剂为聚乙二醇20000。

本发明采用稀乙酸沉淀法去除粘蛋白后制备唾液蛋白样品，并与传统丙酮沉淀法相比较，具有蛋白回收率高、制备时间短、安全无毒、增加低丰度蛋白上样量、图谱清晰易于分析等优点，比丙酮沉淀法更有利于提高基于双向电泳-质谱技术路线唾液蛋白质组学的稳定性、重复性。

附图说明

图1为稀乙酸沉淀法制备的唾液蛋白样品双向电泳银染图谱；

图2为丙酮沉淀法制备的唾液蛋白样品双向电泳银染图谱。

具体实施方式

现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中，所用的药品和仪器如下：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、甘氨酸、TRIS、CHAPS、SDS、碘乙酰氨、固相pH干胶条(IPG strip pH4-7，24cm)等均为GE healthcare公司产品；2-D Quant Kit蛋白定量试剂盒购自Amersham BioSciences公司；透析袋(截留分子量3500)购自上海捷瑞生物工程公司；冰乙酸、聚乙二醇(分子量20000)、丙酮为国产分析纯。UV8500双束紫外分光光度仪购自HITACHI公司；EttanTM IPGphorTM等电聚焦电泳仪，EttanTM DALTSix垂直板电泳仪，UMAX ImageScanner凝胶扫描仪，均购自Amersham BioSciences公司；VarioSkan Flash全波长多功能酶标仪购自热电Thermo公司。

实施例1、唾液样品收集

6例唾液样品来源于本实验室健康女性研究生。年龄24～29岁。唾液收集时间为上午9:00-12:00，收集前2h开始禁食水。用清水漱口后静坐于椅子上，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，口腔唾液积聚至一定量后，将其吐入放置于冰浴中的50ml离心管内，共采集唾液样品6ml(每组3ml)，采集时间为5-10min。

实施例2、唾液蛋白样品制备与测定