[发明专利]一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及具有药用价值的真菌提取物，尤其涉及一种尖顶羊肚菌(Morchella conica)胞外多糖提取物的制备方法及其抗氧化和延缓衰老的应用。

背景技术

对于食用菌多糖的提取和生物活性研究，目前已有报道大多是从食用菌子实体中提取多糖，如方一泓等人用茶树菇(Agrocybe aegerita)子实体经热水提取，Sevage法脱蛋自质，乙醇沉淀得到的茶树菇多糖(食用菌学报，2006，13(4)：63-68)；又如贾建会等人用半合成培养基深层发酵产生的羊肚菌菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌多糖(食品科学，2002，23(4)：59-62)。一方面利用子实体获得的多糖，需耗费大量资源，目前尖顶羊肚菌子实体较难进行人工栽培，自然环境生长采集的野生子实体数量稀少，用来提取多糖成本高；另一方面利用半合成培养基深层发酵对所得的多糖成分及含量影响较大，不利于分离纯化和生理功效鉴定。研究发现，羊肚菌有抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血脂及抗菌等作用，具有重要的开发和利用价值(陈彦等，2008；张利平等，2009；明建等，2009)，但目前还未见有关尖顶羊肚菌胞外多糖抗氧化和延缓衰老作用的相关报道。

发明的内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种培养容易、提取方法简单可靠、成本低的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

本发明的另一个目的在于提供上述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供上述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物在制备抗氧化和延缓衰老作用药物或保健食品中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将尖顶羊肚菌液体发酵液浓缩至原体积的1/3～1/6，得到浓缩液，浓缩温度为50～70℃；

(2)浓缩液采用Sevage法去蛋白、离心，得到去蛋白后的活性提取液；

(3)去蛋白后的活性提取液用1～5倍体积的95％乙醇在0～10℃透析沉降浓缩液中的多糖12～25小时，pH值为4～8，静置析出絮状白色物质，再离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，制得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

所述步骤(2)servge法去蛋白、离心：在浓缩液中加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿、正丁醇体积比为5∶1)，在恒温磁力搅拌器上剧烈搅拌30分钟，温度25℃，用Sigma台式冷冻离心机，温度4℃，以4000rpm的转速离心10分钟，回收上清液，弃去蛋白层及有机溶液。

所述步骤(3)离心条件为：转速4000-5000rpm、时间20-30min，其中优选：转速4000rpm、时间20min。

进行单因素实验以确定最佳条件：①取等量浓缩多糖提取液5份，每组30mL，分装于5个烧杯中，分别加入1～5倍体积的95％乙醇进行醇析，离心收集沉淀，然后测定胞外多糖提取率。②醇析时间选取5h、12h、15h、25h。③分别浓缩至原体积的1/3、1/4、1/5、1/6。④浓缩温度为50℃、60℃、70℃。⑤醇提pH值选取自然、4、5、6、7、8。按以上五方面进行单因素实验，获得最佳醇提条件：发酵液浓缩至原体积的1/5，浓缩温度为60℃，用4倍体积的95％乙醇进行醇析，醇析时间25小时，pH值为6。

所述尖顶羊肚菌液体发酵液是经过尖顶羊肚菌(Morchella conica)液体发酵培养，得到发酵物，再通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得的发酵液。所述离心条件优选：转速4000rpm、时间10min。

所述尖顶羊肚菌(Morchella conica)液体发酵培养是将尖顶羊肚菌(Morchella conica)接种到液体发酵培养基中发酵培养，其液体发酵培养基配方为：葡萄糖150g，硝酸铵6g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O 3.0g，维生素B10.3g，加蒸馏水定容至3000ml。

所述发酵培养的步骤是：(1)取100ml所述液体发酵培养基，经灭菌后，在其中接入3个直径约为4mm的尖顶羊肚菌菌丝块，在25～28℃，转速130～160rpm，避光恒温振荡培养6～8天，得到液体菌种；(2)将上述液体菌种接入3L灭菌后的所述液体发酵培养基中，培养温度为25～28℃，转速为130～160rpm，培养5～9天，得到发酵物，备用。