[发明专利]微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株

权利要求书

1.一种微生物催化法制备2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括：在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈为底物，以庆笙红球菌(Rhodococcusqingshengii)CCTCC No：M 2010050、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC No：M 209214或红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCNo：M 209244发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0～10.0、20～40℃下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应在水或pH6.0～10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为0.03～0.3M。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCC No：M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No：M 209214或红平红球菌CCTCC No：M 209244经发酵获得的含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5～50g/L。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到：

(1)将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCC No：M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No：M 209214或红平红球菌CCTCC No：M 209244接入种子培养基中，于20～40℃下培养24～48h，获得种子液；

所述种子培养基终浓度组成如下：葡萄糖5～20.0g/L，酵母浸出粉2～8.0g/L，蛋白胨1～4.0g/L，KH₂PO₄0.5～1.5g/L，K₂HPO₄0.5～1.5g/L，NaCl 0.5～3.0g/L，己内酰胺0.5～2.0g/L，MgSO₄0.05～0.2g/L，CoCl₂0.01～0.05g/L，FeSO₄0.01～0.05g/L，溶剂为水，pH 6.0～8.0；

(2)将种子液以1～10％体积比接入产酶培养基中，于20～40℃下培养48～96h，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组成如下：蔗糖5.0～10.0g/L，柠檬酸钠2.0～5.0g/L，牛肉膏2.0～8.0g/L，酵母粉2.0～8.0g/L，氯化钠0.5～2.0g/L，磷酸二氢钾0.5～2.5g/L，氯化钴0.005～0.01g/L，氯化铁0.005～0.01g/L，氯化锰0.005～0.01g/L，诱导剂1.0～3.0g/L，溶剂为水，pH 6.0～8.0；所述诱导剂为下列之一：谷氨酸钠、2，2-二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下：将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后，悬浮于水或pH6.0～10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈至底物浓度为0.03～0.3M，于15～40℃、100～200rpm下反应10～60min；反应结束后，转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：反应结束后，取转化液12000rpm离心10min，收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤，得到脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0.1Mpa，水浴加热温度40～60℃、转速60～100rpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品；将2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品溶于20～65℃的乙酸乙酯，加入体积为乙酸乙酯体积10％盐析剂正己烷，于0～4℃保温结晶；过滤，取滤渣用正己烷洗涤，干燥得到2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺晶体。