[发明专利]Ⅱ类猪白细胞表面抗原抑制猪

权利要求书

1.II类猪白细胞表面抗原抑制猪，其特征在于该猪的II类猪白细胞表面抗原SLA被抑制。

2.权利要求1所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)构建DN-CIITA表达载体；

(2)将DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞；

(3)采用体细胞核转移的技术，将DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞转变为克隆猪。

3.根据权利要求2所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于步骤(1)中，构建DN-CIITA表达载体的方法为：提取人淋巴细胞或猪淋巴细胞的RNA，经反转录合成cDNA，DN-CIITA的cDNA缺失前335个氨基酸编码顺序，DN-CIITAcDNA然后插入带有Tie-2增强子、CMV增强子和beta-肌动蛋白启动子的表达载体，并在其5′端加上10个氨基酸的核转移讯号MPKKKRKVHP，构建DN-CIITA表达载体。

4.根据权利要求3所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于缺失前335个氨基酸编码顺序的DN-CIITA cDNA按如下RT-PCR反应获得：

正向引物：5′-CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3′，

反向引物：5′-ATA CAG CCT GGA GAA GAG CTG-3′，

反应体系：5uL 10×LAPCR buffer II，8uL Takara dNTP，10pmol/uL正向引物和反向引物各2uL，0.5uL Takara LA taq polymerase，1uL template DNA，31.5uL PCR gradeH₂O；

反应条件：94℃，2min；30个循环，94℃10sec，60℃30sec，68℃1min(之后每个循环比上一个循环延长40sec，直至20min)；68℃延伸7min；4℃保存。

5.根据权利要求2所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于步骤(2)中，将DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞的方法为：利用电穿孔的方法将线性化的DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞，用G418进行选择，两周后将具有G418抗性的单个细胞克隆进行扩增得到DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞。

6.根据权利要求2所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于步骤(3)中，转变为克隆猪的方法为：体外成熟40～42小时的猪卵子在显微操作下去核，单个DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞经显微注射进入去核的卵细胞，然后通过电击融合，再次电击来激活核转移的卵细胞，100～150个激活的核转移的卵细胞通过外科手术放入激素诱导发情的受体母猪的输卵管，怀孕猪产下转基因猪。

7.权利要求1所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植排斥反应中的应用。

8.权利要求7所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植急性血管性排斥反应中的应用。