[发明专利]中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法

说明书

技术领域：

本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体涉及中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法。

背景技术

硝基精氨酸对一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的抑制具有立体选择性，在体外L-硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine，L-NNA)可有效地抑制NOS，而其D-硝基精氨酸对NOS则几乎无抑制作用。体内一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶催化L-精氨酸氧化生成，一氧化氮作为体内的重要信号分子，具有调节血管阻力、血压、血小板聚集与黏附等多种生物学功能。NOS的催化作用可被L-NNA等精氨酸衍生物所抑制，从而引起动物血压长时间升高、肾脏动脉管腔缩小、动脉管壁局限性的坏死、微细血管堵塞，引起肾脏损伤。但是研究发现在大鼠体内D-NNA具有与L-NNA类似的升高动脉血压的生物活性。研究发现，D-NNA可能在体内发生手性转化。D-NNA手性转化存在两步反应机制：a.D-NNA在肾脏D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)作用下氧化脱氨生成α-酮酸；b.α-酮酸在转氨酶参与下，通过立体选择性获取氨基生成L-NNA，实现手性转化。并进一步发现D-NNA可在大鼠体内单向手性转化生成L-NNA，肾脏是D-NNA发生转化的主要器官。体内D-NNA到L-NNA手性转化的过程中可以产生O₂^-离子。而O₂^-可以和细胞大分子反应，导致脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化。脂质过氧化可能导致膜损伤；DNA过氧化可以产生修复酶的活化作用，使得细胞内能量迅速衰竭，导致细胞死亡；对蛋白质的损害，尤其是酶，可以导致其功能的损伤。因此利用D-NNA建立肾功能损伤动物模型存在两种可行性机制：a.D-NNA在DAAO作用下手性转化为L-NNA，L-NNA可抑制NOS的活性，进而使得NO产生减少，动物血压长时间升高、肾脏动脉管腔缩小、动脉管壁局限性的坏死、微细血管堵塞，引起肾脏损伤；b.D-NNA转化为L-NNA的过程中，产生O₂^-离子，O₂^-离子对生物膜中不饱和脂肪酸(PUFA)的共价键有特殊的亲和力，使其发生一系列反应从而破坏生物膜的完整性和流动性，引起肾脏损伤。

中药治疗肾脏损伤恰恰可以通过改善上述两条途径，一是激活L-Arg-NO途径产生NO，改善肾脏损伤：a.NO抑制血小板的活化，从而抑制血小板的粘附与聚集，阻止其释放5-羟色胺与凝血因子，阻断其凝血反应后的微血栓形成，改善肾脏血流，畅通血液循环；b.NO激活平滑肌细胞膜上可溶性鸟苷酸环化酶(GC)，经过一系列多途径的人体生物反应起到扩张血管平滑肌，改善血液循环。二是部分中药能有效降低MDA水平、提高谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低体内D-NNA手性转化过程中产生的O₂^-离子，防止脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化。目前，中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法国内外文献尚未报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种成本低、使用方便、模型性能稳定、机理明确、适应性广的用于中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的构建方法。

本发明公开了一种中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法，该方法选用SD(Sprague-Dawley)大鼠作为动物模型，D-硝基精氨酸(D-NNA)腹腔注射给予SD大鼠，持续给药2-4个月后，血清中肌酐(Crea)、尿素氮(Bun)的含量明显升高，肾脏组织病理表现为单核细胞浸润、肾小管扩张、间质增生、充血，氧化指标丙二醛(MDA)浓度和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显下降，肾脏组织中的NO水平和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性均明显升高。D-NNA所致肾脏损伤是通过其在肾脏发生手性转化过程中产生大量O₂^-和手性转化产物L-NNA抑制NOS活性建立起来的，该机制与中药治疗肾脏损伤的通路相吻合。

本发明所用动物为SD大鼠，重量80-120克，清洁级；动物模型构建方法：将D-硝基精氨酸(D-NNA)用5％葡萄糖超声溶解，腹腔注射于SD大鼠，剂量为100-150mg/kg/d，每周给药5-7次，持续给药8-16周。