[发明专利]西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用

权利要求书

1.一种西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的序列为：

AIT1F：5‘-GCT GGA TCA CCT CCT TTC TG -3’

AIT2R：5‘-TGA CGC AAT CAA ATT TTT GTC A-3’。

2.根据权利要求1所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物AIT1F/ AIT2R对西瓜细菌性果斑病菌特异性扩增出462 bp的产物。

3.根据权利要求2所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的特异引物序列获得方法为：以西瓜细菌性果斑病菌、多个燕麦食酸菌其他亚种的菌株、食酸菌属内的近缘种以及常见的几种病原细菌为供试材料，采用CTAB—SDS法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取供试菌株细菌培养液1.5 mL加入到1.5 ml Eppendorf管中，12，000 rpm，离心2 min；倒去上清液，加入500 ml 1×TE，用枪头反复吹打混匀；加入5 ml蛋白酶K，30ml 重量浓度10% SDS，轻轻混匀，37℃水浴锅放置1 h；待菌液变透明后，加入100 ml 5 mol/L NaCl混匀，加入80 mlCTAB提取液，轻缓地颠倒离心管数次使样品充分混匀，65℃水浴放置10 min；冷却后加715 ml酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，轻柔颠倒数次，12，000 rpm离心5 min；小心吸取上清至另一新的1.5 ml Eppendorf管，加入吸取上清液等体积的上述酚、氯仿和异戊醇混合溶液，颠倒混匀；12，000 rpm离心5 min，小心吸取上清至另一新的1.5 ml Eppendorf管，加入与吸取上清液等体积的异丙醇，轻柔颠倒数次混匀，-20 ℃放置30 min，12，000 rpm离心5发min，弃上清，加入1 ml 70％乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台中晾干沉淀，无酒精味后加入100 ml 1×TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50 ng/μl，保存于-20℃备用；PCR在获得西瓜细菌性果斑病菌和其他细菌ITS序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，获得西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物特异引物序列，经对供试菌株和30株西瓜细菌性果斑病菌的特异性进行PCR验证，所述特异引物在西瓜细菌性果斑病菌上特异性地扩增出462 bp的产物。

4.根据权利要求3所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述CTAB提取液的配制为重量浓度10% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA， pH8.0；0.7 mol/L NaCl。

5.根据权利要求3所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述1×TE溶液配制为10 mmol/LTris-HCL，0.1 mmol/LEDTA，pH8.0。

6.根据权利要求3所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述对供试菌株和30株西瓜细菌性果斑病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是：PCR反应体系25 μl，包括2.5 μl 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，100~400 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和20 ng模板DNA, d.d.H₂O补足25 μl，PCR反应条件为：94℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，59~70℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min。