[发明专利]一种检测中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种检测中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法，特别是涉及采用高效液相色谱-紫外检测法测定，液相色谱-质谱联用确证中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法。

背景技术：

雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)毒素是两种最主要的B类单端孢霉烯族毒素，属镰刀菌毒素，是镰刀菌属中多种真菌所产生的次生代谢产物，在自然界中分布极为广泛，是自然发生的最危险的食品、农产品污染物，对人畜健康危害十分严重。DON是摄食与生长抑制剂，其毒性作用表现为厌食，恶心呕吐，腹泻，代谢紊乱等，研究发现DON还具有很强的细胞毒性，并对免疫系统和造血系统有损害。NIV常与DON共存，其在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON强10倍。

由于镰刀菌为土壤习居菌，很多中药易受到镰刀菌的侵染，是很多根和根茎类药材根腐病的主要致病菌，而上述镰刀菌中部分为产毒菌，可产生NIV和DON毒素，因此，很有必要对中药中NIV和DON毒素进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。

发明内容

到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对食品、农产品以及饲料NIV和DON毒素的分析，对中药中NIV和DON的分析，目前还是空白。因此对中药中NIV和DON毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的NIV和DON毒素的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本发明克服现有技术不足，选择了适用于中药中NIV和DON毒素的提取、净化方法，优化了高效液相，液质条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的NIV和DON毒素进行测定。

本发明是通过采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药中的NIV和DON毒素的方法，同时建立了中药中NIV和DON毒素的液相色谱-质谱联用确证法。

具体的不同基质中药中NIV和DON毒素测定的方法，可以通过以下步骤实现：

仪器、药品及材料：

仪器：

Waters 600高效液相色谱系统，美国Waters公司，包括：

Waters 600控制器；

Waters 600色谱泵；

Waters 486紫外可见光检测器；

Empower色谱工作站；

CBL Model 100型柱温箱，美国Photoelectron Technology公司；

AgelaVenusilMPC18色谱柱，北京艾杰尔科技有限公司；

RE-52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；

GF-1型高速均质器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

Puri ToxSR TC-T200呕吐毒素(DON)专用净化柱，美国Trilogy分析实验室。

对照品：

DON和NIV标准品都购自日本WAKO公司，纯度≥99％；色谱分析用乙腈、甲醇均为为色谱纯，美国Thermo Fisher科技公司；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。。

样品：

所测中药样品均为市场上随机购买而来，经北京协和医学院药用植物研究所张本刚教授鉴定，低温干燥后备用。

1、高效液相色谱检测法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素

a.色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器，检测波长：218±2nm，以水-乙腈-甲醇为流动相，流速：0.8-1.0mL/min；柱温20-30℃。

b.溶液配制：

对照品溶液的制备：取NIV和DON标准品适量，加流动相或乙腈制成溶液；

c.样品溶液的制备：

样品提取：取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加乙腈-水混合溶剂，提取，静置，过滤，滤液备用。

样品净化：吸取上述滤液到呕吐毒素专用净化柱顶端，过柱，收集纯化液到梨形瓶中，加乙腈-水(80：20，V/V)洗柱两次，收集至上述梨形瓶中，减压蒸干。残渣加甲醇或流动相溶解，过滤后备用。

d.测定法：分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。

2、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。

a.液相条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-醋酸铵水为流动相；柱温20-30℃；