[发明专利]一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因，以及该(+)γ-内酰胺酶的应用。

背景技术

目前，资源、能源和环境危机已经威胁到人类的生存与发展。生物转化是以微生物或酶作为催化剂，以可再生资源取代不可再生资源，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等的有效手段。

(-)γ-内酰胺是合成抗艾滋病药物阿巴卡韦以及抗甲型流感及禽流感药物帕拉米韦的重要的中间体。目前合成手性(-)γ-内酰胺的方法主要分为化学合成法，手性助剂共结晶法和生物酶促转化法。化学法方法成本高、步骤烦琐，而且催化过程中使用的重金属催化剂严重污染环境。以手性助剂为拆分剂的方法收率较低，且终产物中有拆分剂残留。生物酶法在合成手性(-)γ-内酰胺中，具有节约能源，效率高，对环境友好的特点。

酶法拆分消旋体γ-内酰胺

能够水解拆分消旋γ-内酰胺的酶被称为γ-内酰胺酶。γ-内酰胺酶属于酰胺酶的一种，γ-内酰胺酶主要应用于(-)γ-内酰胺的手性合成中，(-)γ-内酰胺是制备阿巴卡韦及帕拉米韦的关键手性中间体。

目前所报道的γ-内酰胺酶对消旋γ-内酰胺的拆分过程中存在的缺点主要是，γ-内酰胺酶对消旋γ-内酰胺酶底物的拆分不具有绝对选择性，所以拆分效果依赖于拆分反应的过度反应，即需要超过50％的反应转化率。这种不具绝对选择性的酶很容易造成产物光学活性降低或者目的光学产物的损失。此外，虽然来源于硫磺矿硫化叶菌的γ-内酰胺酶具有绝对选择性，但是其最适反应温度过高(80℃)，利用此酶进行生产过程的能耗很大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因。该(+)γ-内酰胺酶具有绝对选择性，可用于消旋体γ-内酰胺的拆分，制备获得光学纯的(-)γ-内酰胺。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明所提供的(+)γ-内酰胺酶被命名为MHlac，来源于氧化烃微杆菌L29-9(Microbacterium hydrocarbonoxydans)CGMCC No.2085。

(+)γ-内酰胺酶MHlac是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ IDNO：1衍生的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID NO：1由150个氨基酸残基组成。

上述(+)γ-内酰胺酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一：

(a)序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

(b)编码序列表中SEQ ID NO：1蛋白质序列的多核苷酸。

其中，序列表中的SEQ ID NO：2由450个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第450位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明所述的(+)γ-内酰胺酶MHlac是通过如下方法制备的：培养氧化烃微杆菌获得细胞，获得的细胞进行总DNA提取，提取的总DNA用Sau3AI内切酶进行酶切，酶切后的DNA用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收3kbp～6kbp的条带。回收的条带用T4连接酶连接到用BamHI内切酶处理的pUC19质粒上。连接产物转化E.coli DH5α，转化产物涂到加有50μg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG的LB平板上，转化的菌落培养18小时。准备和平板同样大小的滤纸，用2mg/mL的γ-内酰胺甲醇溶液浸透，甲醇挥发干之后将此滤纸覆盖在转化平板上30分钟之后，将此滤纸放入37℃的培养箱反应4小时。反应结束之后将溶解在丙酮里的2％茚三酮喷洒到滤纸上，在80℃放置5分钟，阳性克隆的周围有褐色的晕圈。通过此方法筛选到一个阳性克隆。将此克隆测序后设计引物进行PCR，构建好的蛋白基因含有氨基端和羧基端的组氨酸标签蛋白。将构建好的表达载体导入宿主细胞，表达得到γ内酰胺酶MHlac。