[发明专利]一种谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断吸水链霉菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断吸水链霉菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，transglutaminase，EC2.3.2.13，简称TGase)是一种催化酰基转移反应的转移酶。它能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。谷氨酰胺转胺酶存在于在动物、植物、微生物中，目前工业生产谷氨酰胺转胺酶的菌株为链霉菌。

目前国内外的研究主要集中于提高谷氨酰胺转胺酶，例如：申请号为：200710023771.2的专利，一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达；申请号为：200610097160.8的专利，添加胰蛋白酶提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法。

关于链霉菌中谷氨酰胺转胺酶功能及谷氨酰胺转胺酶基因阻断吸水链霉菌研究还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株谷氨酰胺转胺酶编码基因被阻断的吸水链霉菌。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

构建阻断载体，转化吸水链霉菌，通过抗性平板筛选和PCR验证得到谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断菌株。

所述阻断载体是将含有不跟目的基因的片段插入到温度敏感型质粒pKC1139中，构建的重组质粒pKC1139-TG1。

谷氨酰胺转胺酶基因阻断的具体步骤如下：

(1)根据谷氨酰胺转胺酶编码基因序列设计扩增含有同源片段的引物，在5’和3’端引入HindIII(AAGCTT)和EcoRI(GAATTC)酶切位点，回收PCR片段；

(2)PCR产物经HindIII和EcoRI酶切后与相同酶切的pKC1139质粒连接，得到重组质粒pKC1139-TG1；

(3)将构建的重组质粒pKC1139-TG1转化吸水链霉菌原生质体；

(4)将转化后的原生质体涂布在链霉菌原生质体再生培养基上，培养18h后，加入阿伯拉(Apramycin)抗生素；

(5)将上述平板得到的菌落转移至新的Apramycin平板生，39℃培养，挑选长出来的菌落，提取基因组进行鉴定，即可得到谷氨酰胺转胺酶基因阻断菌株。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供所述工程菌的应用方法。

所述工程菌用于吸水链霉菌外源或内源基因的表达。

所述工程菌用于发酵生产抗生素。

所述抗生素为阿扎霉素B，尼日尼亚菌素。

本发明具有的优点：(1)本发明得到的吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断菌株，在生长过程中营养菌丝阶段可以正常生长，但是不能够分化形成气生菌丝，阻断了其分化的过程，可用于链霉菌在发酵过程中由于分化过程而引起的代谢产物变化，影响发酵产量及稳定性，将极大促进后续链霉菌基因改造和微生物生理学研究，为链霉菌发酵生产提供一个新的模式菌；(2)本发明的基因阻断方法简单，高效，对同源交换片段要求较短，容易实现。

附图说明

图1pKC1139-TG1物理图谱及其验证

A：质粒图谱；B：PCR验证C：双酶切验证

图2谷氨酰胺转胺酶基因阻断菌株PCR验证

A：验证MTG突变株的示意图；B：用P1和P3为引物PCR得到的产物电泳图，根据图A，PCR产物大小为3000bp。1，2，3：MTG突变株；4：S.hygroscopicus；M：Maker；C：以引物P1和P3的PCR产物为模板的PCR产物电泳图D：阿伯拉霉素抗性基因的PCR产物电泳图

图3野生菌株和重组子谷氨酰胺转胺酶酶活比较

A：固体平板酶活检测；B：液体酶活检测。N：没有检测到酶活

图4谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断菌株的生长情况观察

图5TGase表达载体pIJTGM1的构建

具体实施方式：

实施例1吸水链霉菌中谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断

1、目的片段基因TG1获得

利用引物：

Y1：5′-TTTAAGCTT CCACTGTGAGTGCGGCGATA-3′(下划线，黑体字为Hind III位点)；Y2：5′-AAAGAATTCTTCCGTCTGAGCCCCAAACC-3′(下划线，黑体字为Eco RI位点)从吸水链霉菌基因组上扩增得到敲除片段TG1。