[发明专利]HLA-A,B基因分型用PCR引物及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是PCR测序技术领域。特别地，本发明提供了用于HLA-A，B(第二代测序法)基因分型的PCR引物。另一方面，本发明的方法涉及DNA序列的分型方法，特别是HLA基因高分辨率分型方法。

背景技术

人类白细胞抗原，即HLA(human leukocyte antigen，HLA)，是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一，它是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统，与同种异体器官移植的排斥反应密切相关。研究发现，移植时，供受双方的HLA相关基因匹配程度越高，分辨率越高，移植物的存活时间越长。

目前国际标准的HLA基因分型技术包括PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT(聚合酶链式反应产物直接测序分型)。

HLA-SSP的原理是设计出一整套等位基因组特异性引物，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，通过电泳分析决定HLA型别。HLA-SSO的原理是设计HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，把PCR产物标记，以PCR产物(待检测基因DNA)与探针杂交。通过检测荧光信号判断HLA型别。HLA-SSP和HLA-SSO的检测信号均是模拟信号，分辨率只能到达中低水平且都不能检测新的等位基因。

HLA-SBT是一种通过对HLA基因的相关区域(HLA-A/B基因分型一般同时扩增2，3，4外显子用于分型，其PCR产物长度都在1kb以上)PCR扩增后的DNA产物直接进行Sanger法测序(毛细管 微电泳)，测定核酸序列，从而判断HLA基因型别的高分辨分型方法，其具有直观、高分辨且能检测新的等位基因的特点。HLA-SBT整个实验流程复杂、通量低和实验成本高等缺点使其很难应用于大规模HLA高分辨分型项目。

基于以Illumina GA(Illumina公司的Genome Analyzer测序仪)和Roche 454(Roche公司)为代表的第二代测序法(以下简称新测序技术)的HLA-SBT也是一种通过对PCR扩增后的DNA产物直接测定核酸序列，从而判断HLA基因型别的高分辨分型方法，其除了原有直观、高分辨且能检测新等位基因的特点外，还具有单分子测序特点。其结合PCR-index/barcode技术，通过在PCR引物的5’末端添加引物标签(primer index)序列合成标签引物，可在PCR过程中对每个样本引入独特的引物标签，使样本在利用第二代DNA测序技术检测过程中，除PCR环节必须逐个样本处理外，其它实验环节可把多个样本混在一起同时处理，最终每个样本的检测结果可以通过其独特的引物标签序列找回；使该方法具有成本低，通量大和可同时检测大量样本的多个不同基因位点的特点。但与第一代测序技术(以Sanger法测序原理为基础的测序技术)相比，能用于新测序技术测序文库制备的DNA长度不能太长(Illunina GA的最大适用长度为700bp)，再加上新测序技术读长普遍偏短，当前Illumina GA双向读长只能达到200bp，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再适用。结合HLA新测序技术的特点，PCR产物的长度不宜超过700bp。

发明内容

鉴于现有新测序技术对DNA模板长度的要求和新测序技术读长偏短的事实，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再适用以新测序技术为基础的HLA高分辨分型方法。本发明设计了一套全新的分别单独扩增HLA-A，B基因的2，3，4号外显子的特异性和保守性良好的PCR引物，且PCR产物长度不大于700bp，特别适用于Illumina GA(当前Illumina GA适用的最大DNA长度为700bp)。本发明所提供 的一套PCR引物可用于对受试者(特别是人)进行大规模、高通量和低成本的HLA基因分型。

本发明采用的技术方案是，从IMGT/HLA因特网站点(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)下载所有最新HLA-A/B基因序列，然后保存到本地磁盘中做为HLA-A数据集；同时下载所有最新非HLA-A的HLA-I类基因序列做为比较数据集。将两数据集进行比较，在2，3，4号外显子两端和内部寻找各基因位点保守和特异序列，并将设计的PCR引物序列与人类全基因组序列进行同源性比较。由于HLA-A/B基因与同属于HLA-I类分子的其它基因具有很高的序列相似性，在设计PCR引物时尽量保证引物3’末端特异，确保引物扩增HLA-A/B基因的特异性。同时使PCR产物的长度小于700bp，且正反引物的退火温度基本保持一致。