[发明专利]甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒

权利要求书

1.一种利用酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述甘氨酸转氨酶、谷氨酸合成酶的系列催化反应完成：

甘氨酸+酮戊二酸 甘氨酸转氨酶 乙醛酸+谷氨酸

谷氨酸+辅酶 谷氨酸合成酶 谷氨酰胺+酮戊二酸+还原型辅酶

2.一种甘氨酸的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

2.1样品准备：

2.1.1标准样品的制备

将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到1毫摩尔/升；

2.1.2待测样品的制备

待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；

2.1.3空白样品

所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；

2.2试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸合成酶与酮戊二酸，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L与1-100mmol/L；

2.3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；

2.4在与步骤2.3)同样的条件下测定步骤2.1.1)标准样品的吸光度随时间的变化；

2.5在与步骤2.3)同样的条件下测定在步骤2.1.3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；

2.6数据处理

由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量：

式中：

ΔA(样品)表示步骤2.3)得到的待测样品的吸光度变化；

ΔA(空白)表示步骤2.5)得到的空白溶液的吸光度变化；

ΔA(标准)表示步骤2.4)标准样品的吸光度变化。

3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定：测定方法为终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为正反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。

4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的辅酶是一种或多种选自NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺的辅酶。

5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于：

5.1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂：

它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、酮戊二酸、甘氨酸转氨酶与谷氨酸合成酶组成的；

5.2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂：

试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶与酮戊二酸组成的；

试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、甘氨酸转氨酶与谷氨酸合成酶组成的；

其中辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸合成酶、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。

5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂：

试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶与酮戊二酸组成的；

试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂与谷氨酸合成酶组成的；

试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与甘氨酸转氨酶组成的；

其中辅酶、甘氨酸转氨酶、谷氨酸合成酶、酮戊二酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。

6.一种甘氨酸测定试剂盒，其特征在于：

6.1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂：

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

辅酶                          0.1-5mmol/L

甘氨酸转氨酶                  1000-80000U/L

谷氨酸合成酶                  1000-80000U/L

酮戊二酸                      1-100mmol/L。

6.2根据权利要求6.1所述的甘氨酸测定试剂盒，其特征在于它有：

组成如下的试剂1：

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

辅酶                          0.1-5mmol/L

酮戊二酸                      1-100mmol/L；

组成如下的试剂2：

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

甘氨酸转氨酶                  1000-80000U/L

谷氨酸合成酶                  1000-80000U/L。

6.3根据权利要求6.1所述的甘氨酸测定试剂盒，其特征在于它有：

组成如下的试剂1：

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

辅酶                          0.1-5mmol/L

酮戊二酸                      1-100mmol/L；

组成如下的试剂2：

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

谷氨酸合成酶                  1000-80000U/L；

组成如下的试剂3：

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

甘氨酸转氨酶                  1000-80000U/L。