[发明专利]甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及甘氨酸测定方法及其试剂盒。 

【背景技术】

甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味，能缓和酸、碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。甘氨酸不能被人体利用，只能分解转化为热能，这样会增加肝脏负担。而分解产物中的含氮化合物要通过尿液排出体外，又会增加肾脏负担。如果大量、长期食用这类食品，可能造成肝肾损伤。部分含乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量，在生产加工中违规使用甘氨酸，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。 

按照我国《食品添加剂使用卫生标准》GB2760规定，甘氨酸在作为食品添加剂只允许在调味剂与豆奶中使用，且最高限量为每公斤1克，但在含乳饮料中不允许使用。 

【发明内容】

[要解决的技术问题] 

本发明的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。 

本发明的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。 

[技术方案] 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

本发明的方法是一种采用间接酶循环扩增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple  Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。 

本发明甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、丙二酸半醛脱氢酶的系列催化反应完成： 

甘氨酸+2辅酶  氰化氢合成酶  氰化氢+二氧化碳+2还原型辅酶 

二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型铁氧还蛋白  丙酮酸合成酶  丙酮酸+ 

辅酶A+氧化型铁氧还蛋白 

辅酶A+3-甲酰乙酸+辅酶  丙二酸半醛脱氢酶  二氧化碳+乙酰辅酶A 

还原型辅酶 

本发明的方法利用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase；EC 1.4.99.5)酶(偶)联丙酮酸合成酶(pyruvate synthase；EC 1.2.7.1)、丙二酸半醛脱氢酶(malonate semialdehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.18)酶促反应连续监测法。氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶作为作用酶，氰化氢合成酶功能为将甘氨酸酶解产生二氧化碳，丙酮酸合成酶的酶促作用使二氧化碳产生辅酶A；丙二酸半醛脱氢酶作为循环酶：丙二酸半醛脱氢酶再将辅酶A再次变回二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用。丙二酸半醛脱氢酶又作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

本发明涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下： 

A、样品准备： 

A.1标准样品的制备 

将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升， 得到的溶液作为标准样品； 

A.2待测样品的制备 

待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 

A.3空白样品 

所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升； 

B、试剂溶液的制备： 

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸合成酶、丙二酸半醛脱氢酶、还原型铁氧还蛋白、乙酰辅酶A与3-甲酰乙酸，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L；