[发明专利]一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种4-氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

偶氮染料(偶氮基两端连接芳基的一类有机化合物)是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，在特殊条件下，它能分解产生20多种致癌芳香胺，经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。偶氮是国际环保要求的必检项目之一，检验方法有以下三种：薄层色谱法(TLC)，气相色谱及质谱联用法(GC-MSD)及高效液相色谱法(HPLC)。标准规定被检产品中不得含有23种偶氮染料中间体，若检出其中一种即为不合格产品，其限量为30ppm。4-氨基偶氮苯是这些有害芳香胺中的一种，在欧盟公布的偶氮染料标准中，4-氨基偶氮苯属于禁用芳香胺中的MAK(III)A 2组中的一种。国外大部分现行相关标准法规都将4-氨基偶氨苯列入禁用芳香胺行列，如德国《食品及日用消费品法》等，而国内在涉及纺织品、染料、皮革制品的标准都没有将其列入，由于检测技术的限制，常规的检验方法无法对其进行检测。近年来，国内外已经开展了对偶氮类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对4-氨基偶氮苯的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备4-氨基偶氮苯人工抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法。所制备的产品用于4-氨基偶氮苯的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，以4-氨基偶氮苯为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；

(1)人工抗原的制备：

A液：取4-氨基偶氮苯0.1mmol溶于2mL 1，4-二氧六环中，冰浴，加入1M盐酸调pH 2.0，冰浴，加入0.02M亚硝酸钠至淀粉试纸变蓝，4℃下，搅拌孵育30min，为A液；

B液：牛血清白蛋白BSA 0.001mmol溶于2mL、pH 9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中，4℃保存待用，为B液；

将A液逐滴加入B液中，调pH 9.0，然后置4℃下温孵半小时，室温反应4小时，即得4-氨基偶氮苯人工抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将4-氨基偶氮苯人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L(每次2L，共2次)的0.0lM的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L(每次2L，共2次)的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4-氨基偶氮苯人工抗原；

(2)人工抗原的鉴定：

4-氨基偶氮苯人工抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

摩尔吸光系数ε：配制4-氨基偶氮苯浓度为0，10，20，30μg·mL^-1的0.01M的PBS溶液，通过紫外扫描可知4-氨基偶氮苯的最大吸收波长为400nm，在400nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

偶联比测定：配制150μg·mL^-1牛血清白蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL^-1，在400nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，样品溶液、空白液测出的吸光值分别为A₁，A₂，则偶联比率γ为：γ＝[(A₁-A₂)/ε]/(150×10^-3/66200)。